乳酸生成菌的乳酸发酵调控及分子改造

论文摘要

论文介绍了乳酸的分类、用途及其发酵方式与生产、产乳酸菌的种类;通过几种乳酸产生菌分别以葡萄糖和木糖为碳源的乳酸发酵,研究其最适发酵条件。从目前的研究水平,通过改变培养条件来得到100%光学纯度的乳酸非常困难。已经有报道通过对pH值、温度、氮源量和糖浓度等因素初始发酵条件的研究,观察乳酸生成菌株的产物光学纯度以及产乳酸量的影响。本实验在几种产乳酸菌最适发酵条件的基础上研究了发酵调控方法,以更高的光学纯度、更低的成本和更大的产物量生产乳酸。通过在发酵前期对底物添加L-乳酸或D-乳酸,分别考察了发酵初期添加乳酸调控对米根霉菌、大肠杆菌、乳酸发酵细菌产物光学纯度的影响。发酵初期在米根霉菌的发酵养培基中添加L-乳酸可以调控提高发酵产物乳酸的光学纯度。随着添加L-乳酸量的增加,所产L-乳酸的光学纯度随之增加,当L-乳酸的添加量≥1.5 g/L时,不再产生D-乳酸。同时,L-乳酸的产量、糖转化率、生物量也随之降低。该调控方法对大肠杆菌发酵调控产D-乳酸纯度没有效果,对乳酸菌调控产L-乳酸光学纯度影响不大。为了提高大肠杆菌的D-乳酸发酵产量,对大肠杆菌W3110进行钴60诱变,通过比较实验挑选出D-乳酸高产菌株。通过基因改造大肠杆菌利用木糖发酵产D-乳酸,提高五碳糖利用率,转化为更多的发酵产物。构建表达大肠杆菌五碳糖代谢的关键基因:木酮糖激酶基因（xylB）、转醛醇酶基因（talA）、转酮醇酶基因（tktA）、木糖异构酶基因（xylA）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 乳酸简介
• 1.2 乳酸的用途
• 1.3 乳酸的发酵菌种及特点
• 1.4 乳酸的生产
• 第2章 乳酸生成菌的乳酸发酵实验
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.1.5 菌种培养与发酵方法
• 2.1.6 检测方法
• 2.1.6.1 标准曲线
• 2.1.6.2 HPLC 测定方法
• 2.1.6.3 生物传感仪法
• 2.1.6.4 分光光度计测定菌体浓度
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 大肠杆菌W3110 的发酵产乳酸实验
• 2.2.1.1 不同接种量的对比试验
• 2.2.1.2 含不同糖浓度的M9 培养基对比试验
• 2.2.1.3 溶氧量对比试验
• 2.2.1.4 大肠杆菌W3110 以葡萄糖为碳源的发酵实验
• 2.2.1.5 大肠杆菌W3110 以木糖为碳源的发酵实验
• 2.2.1.6 大肠杆菌W3110 的钴60 诱变试验
• 2.2.2 乳酸菌
• 2.2.2.1 三种乳酸菌以葡萄糖为碳源的乳酸发酵实验
• 2.2.2.2 乳酸细菌以木糖为碳源的发酵实验
• 2.2.3 米根霉HZS6
• 2.3 本章小结
• 第3章 乳酸调控提高乳酸生成菌的产乳酸光学纯度实验
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器和设备
• 3.1.5 菌种培养与发酵方法
• 3.1.6 检测方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 添加L-乳酸对米根霉产物光学纯度的影响
• 3.2.2 添加L-乳酸对乳酸细菌产物光学纯度的影响
• 3.2.3 大肠杆菌测定结果与分析
• 3.3 本章小结
• 第4章 分子改造大肠杆菌低氧诱导五碳糖代谢合成乳酸研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 菌种
• 4.1.4 主要仪器和设备
• 4.1.5 菌种培养与发酵方法
• 4.1.6 检测方法
• 4.1.6.1 HPLC 测定法
• 4.1.6.2 标准曲线
• 4.1.6.3 分光光度计测定菌体OD 值
• 4.1.6.4 SDS-PAGE 检测
• 4.1.6.5 RT-PCR 检测
• 4.1.7 试验流程
• 4.1.8 质粒构建
• 4.1.8.1 细菌总DNA 及质粒的提取
• 4.1.8.2 PCR 扩增xylA、xylB、talA、tktA 基因
• 4.1.8.3 酶切
• 4.1.8.4 连接
• 4.1.8.5 细菌感受态的制备
• 4.1.8.6 转化
• 4.1.9 重组子筛选与验证
• 4.1.9.1 菌落的PCR 验证
• 4.1.9.2 质粒的PCR 验证
• 4.1.9.3 质粒的双酶切验证
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 质粒的构建
• 4.2.1.1 质粒的构建流程图
• 4.2.1.2 PCR 扩增xylA、xylB、tktA、talA、Pvgb 基因
• 4.2.1.3 质粒的构建
• 4.2.2 重组大肠杆菌生产菌株的构建
• 4.2.3 基因工程菌E.coliW3110（ΔadhE,ΔpflB）的生理特性
• 4.2.4 重组大肠杆菌菌株抗性遗传稳定性的检测
• 4.2.5 大肠杆菌W3110 重组菌株发酵生产乳酸
• 4.3 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文