芒果苷糖酯衍生物的非水相酶促合成及其抗炎活性研究

论文摘要

1目的与意义芒果苷（Mangiferin,MGF）是一种具有Xanthone结构的葡萄糖C-糖苷（分子式为C19H18O11,分子量为422.34）,存在于漆树科植物芒果（Mangifera indica L.）的果实、叶、树皮,百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的根茎、地上部分,鸢尾科植物射干（Belamcanda chinensis（L.）DC.）的花、叶等植物中。MGF分子具有较大的平面结构,溶解度较差（在纯水及pH 1.37.4的缓冲溶液中平均溶解度<1mg·mL-1）,而经换算人的口服有效剂量为630mg,溶解单剂量MGF需要的胃肠道的液体体积>250mL,根据生物药剂学分类系统（Biopharmaceutics classification system,BCS）的定义MGF属于一种溶解性差的药物。此外,MGF在正丁醇-水系统中分配系数（Oil/water partition coefficient,P）非常小（pH14时,P值约为2.3,当pH值大于6.86时,P值仅为0.01）,通常P值与胃肠通透性相关性较好,P值在1001000时,被动吸收较好,推测MGF胃肠通透性较差。再者,MGF在小鼠体内肠道吸收效果较差,证实了MGF通透性差。综合MGF上述三方面的性质,MGF的低油水分配系数可能与其在小鼠体内低生物利用度直接相关,按照生物药剂学分类系统（BCS）原则,MGF可归类为BCS第4类药物（低溶解性-低通透性）,此类药物一般存在严重的生物利用度问题。MGF具有丰富的药理作用,包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节作用、抗糖尿病作用等。因此,课题组拟将MGF开发成为一种具有抗炎作用的新药,但研发过程中发现MGF存在严重的吸收问题。MGF在人体中的抗炎剂量为630mg/次,一日3次,作为一个纯度在90%以上的单体化合物,服用剂量显然很大。将MGF开发成新药,必须解决MGF低吸收的问题,如果提高了MGF吸收的生物利用度,药效提高,最终能调整MGF的给药量。目前,课题组已经开展提高MGF溶解性的研究（应用的技术包括成盐、磺酸盐、金属离子螯合物、制剂手段提高溶解度等）,而在提高MGF通透性方面的研究尚属空白。将低脂溶性药物制备成酯类化合物或前药,从而提高药物的油水分配系数,是提高该类药物胃肠通透性（即被动吸收）的最常用的前药设计策略。MGF具有黄酮类结构,还有多个酚羟基及糖基上的多个羟基,可以对这些羟基进行酰化修饰,增加药物分子整体脂溶性。采用化学法对黄酮类化合物进行酰化,空间选择性不高,并且将活性酚羟基酰化,导致抗氧化活性降低。本文利用脂肪酶的酯化反应或酯交换作用,可选择性将化合物酯化修饰,不但提高黄酮类化合物的脂溶性,还能提高其稳定性及抗氧化活性。脂肪酶（Lipase,EC 3.1.1.3）,即三酰基甘油酯水解酶,该酶催化天然底物油脂的水解,生成的产物包括脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶被广泛用于酯、硫羟酸酯、酰胺类化合物、多元醇酯、多元酸酯三酰甘油酯及一些疏水性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。在非水有机溶剂中,脂肪酶Novozym 435对葡萄糖基6位羟基专属性很高,可以催化葡萄糖的单酰化。为此,本论文针对MGF低油水分配系数,从提高MGF通透性角度出发,采用酶法合成MGF酯类前药,尝试解决MGF生物利用度问题,达到提高药效的目的。理论上,还可为BCS 4类药物的研发提供思路。2方法和结果全文对MGF进行结构修饰,合成酯类前药,并对产物结构及相关理化性质进行测定,最后测定该前药的抗炎活性。方法与结果如下:（1）该部分对MGF溶解度及油水分配系数进行研究。采用HPLC法测定MGF在pH为1.32,2.52,3.32,4.50,5.00,6.86,7.40,8.01缓冲溶液中的平衡溶解度。结果显示MGF的溶解度随pH提高而增加。在pH 1.35.0的溶解度约为0.16 mg·mL-1;在pH 6.867.4时溶解度增加至0.82 mg·mL-1;当pH 8.01时溶解度为1.44 mg·mL-1。采用摇瓶-HPLC法测定MGF在正辛醇-缓冲溶液（pH 1.32,2.52,3.32,4.50,5.00,6.86,7.40,8.01）体系中的表观油水分配系数（P）。MGF的油水分配系数随pH增加而降低,P值从2.313降低至0.05。根据生物药剂学分类系统（BCS）,推测MGF属于BCS 4类药物（低溶解度-低通透性药物）。提示,可以通过合成MGF脂溶性前药,提高脂溶性达到提高MGF通透性的目的。（2）本部分对MGF糖酯衍生物的非水相酶促合成的可行性进行研究。以MGF为酰基受体,以甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯为酰基供体,利用商品脂肪酶Novozym 435为催化剂,在二氧六环中经过转酯化反应,合成了3种酰化的MGF糖酯衍生物,经HPLC-MS分析鉴定3种产物为甲酰基MGF、乙酰基MGF、丙酰基MGF。从HPLC图谱及TLC图谱分析,衍生物的脂溶性均明显提高,达到目标化合物预期目的。（3）本部分对6′-O-丙酰基芒果苷（PMGF）合成、分离、结构鉴定进行研究,并对合成条件进行优化。首先,以MGF为酰基受体,丙酸乙酯为酰基供体,利用脂肪酶在有机溶剂中的酯交换作用,在MGF糖基6′-OH选择性酰化。其次,采用制备液相色谱法分离得到高纯度PMGF。然后,测定产物的MS谱、一维1H-NMR和13C-NMR确定分子量及分子结构,并测定（g）-HMBC及（g）-HMQC对C、H进行归属,确定酰化位置,最后确证产物结构为6′-O-丙酰基芒果苷。最后,优化酶促反应条件,优化后的酶促反应条件为:在8 mL二氧六环中加入30 mg Novozym 435、芒果苷30mg、丙酸乙酯1mL,在恒温水浴振荡摇床中60℃下反应20h。（4）对PMGF水溶解度、油水分配系数、体外水解稳定性进行考察,并与MGF做对比研究。首先,采用摇瓶法测定PMGF在纯水（37℃）的溶解度,结果显示PMGF溶解度为0.166±0.02μg·mL-1,与同条件下MGF的溶解度接近,PMGF并未由于脂溶性提高而导致水溶解度下降。其次,采用HPLC法测定PMGF在正辛醇-缓冲溶液中的油水分配系数,结果显示PMGF在pH 1.38.01范围内油水分配系数由21.104降低至0.108,比MGF均显著增加4.3392.36倍,其中在中性及碱性环境下提高倍数均在10倍以上,尤其在模拟肠液的pH（pH7.4）环境中增加了93.36倍,预测PMGF在肠道通透性将有很大程度提高。然后,采用HPLC法测定PMGF在pH 2及7.4溶液中的水解稳定性。PMGF在该溶液中均能缓慢水解为MGF。PMGF在pH2的酸性溶液中,按照一级速度过程水解为MGF,半衰期为69.3h;在pH 7.4偏碱性溶液中,水解为MGF的比例及速度较慢,部分PMGF变成3种脂溶性高于MGF的未知产物（推测是丙酰基转移到其他羟基后形成的产物,脂溶性仍然比MGF有所提高）,导致PMGF浓度下降较快,半衰期为34.6h。最后,PMGF浓度在血浆中按照非线性速度过程水解变成MGF,半衰期为11.720.6h。综合上述内容,与原型MGF相比较,PMGF在不降低溶解度前提下脂溶性显著提高,在胃肠pH环境下能缓慢水解（水解半衰期>30h）为MGF,主要在血浆中水解为原型MGF。推测将MGF修饰为PMGF能显著提高MGF的胃肠通透性,在吸收的时间段内,PMGF比例较大,吸收入血后,能顺利水解还原为MGF,提示,PMGF很有潜力作为MGF的前药。（5）本部分研究了人肠道菌群对MGF和PMGF的代谢作用。采用离体代谢研究的方法,用富含人肠道菌群的培养液与MGF/PMGF在厌氧条件下共同孵育,采用大孔树脂、制备液相色谱法分离代谢产物,经HPLC-MS、一维1H-NMR和13C-NMR确证代谢产物结构为MGF苷元（Norathyriol）。结果如下:PMGF在孵育开始02h内全部水解为MGF,孵育第48h时间段PMGF和MGF逐步代谢为Norathyriol,第7h的Norathyriol浓度达到最高,随后Norathyriol浓度持续下降,第12h仍然有明显代谢产物。证实,PMGF转化为MGF的主要部位是肠道,暴露在肠道菌群环境中仅需要2h就能将PMGF分解完全;MGF及PMGF在肠道菌群作用下转化为Norathyriol,时滞4h。在肠道菌群作用下,PMGF完全水解需要2h,推测在此水解阶段,未被水解的高脂溶性的PMGF持续吸收,净效应就是PMGF的吸收速度与程度会比原型MGF的要高。此外,代谢产物Norathyriol吸收的特征,有待进一步研究。（6）对比研究了PMGF的体内、体外抗炎活性。首先,利用小鼠巨噬细胞株RAW264.7在脂多糖刺激下产生炎性细胞因子,观察PMGF和MGF对炎性细胞因子生成的影响,结果显示低浓度(5μg?mL-1)MGF及PMGF体外对NO、IL-1、TNF-α无显著抑制作用（抑制率<7%）。其次,小鼠二甲苯致耳肿胀试验表明,MGF和PMGF均显示显著的抗炎作用（抑制率>30%,P<0.05）,PMGF中、低剂量组的抗炎效果高于MGF中、低剂量组但无显著性差异（P>0.05）,提示,PMGF中、低剂量组药效具有高于同剂量的MGF的趋势,出现以上现象,可能由于提高MGF脂溶性改善膜通透性,增加了MGF经小鼠胃肠道的生物利用度,达到增效的目的。3结论针对MGF溶解度低且油水分配系数低的特性,围绕MGF结构修饰主题,通过酶催化反应,最终找到高活性的高脂溶性的MGF前药—PMGF,PMGF的溶解度与原型MGF相当,但PMGF脂溶性显著提高,抗炎药效有优于MGF的趋势,有理由认为PMGF作为MGF前药是有效的。以上研究,为MGF前药的研究提供了新的化合物结构类型,为有目的的开发MGF新药奠定了基础。本文对难溶性药物的开发研究亦有一定的指导意义。本文从通透性方面入手,提高MGF脂溶性,动物药效证明酯类前药PMGF抗炎效果有优于MGF的趋势。可见,从通透性方面改善BCS 4类药物的生物利用度是行之有效的。4创新点（1）首次利用固定化脂肪酶Novozym 435在非水相中合成了3种MGF脂溶性衍生物甲酰基MGF、乙酰基MGF、丙酰基MGF。（2）提高MGF脂溶性,动物实验证实达到增效的目的。（3）首次将BCS指导原则应用到MGF研究中,以“增加脂溶性来改善膜通透性”为指导思想,指导整个MGF前药的设计,并取得良好的效果。

论文目录

中文摘要

ABSTRACT

中英文对照

第一章绪论

1 芒果苷研究概述

1.1 植物来源

1.2 理化性质及生理活性

1.2.1 MGF 的理化性质

1.2.2 MGF 的生理活性

1.3 MGF 的结构修饰

1.3.1 烷基化MGF

1.3.2 MGF 磺酸钠

1.3.3 MGF 钠盐

1.3.4 MGF 糖基化修饰

2 药物的生物药剂学分类系统

3 提高脂溶性的目的

4 生物催化和脂肪酶的应用

4.1 酶法结构修饰改性

4.2 脂肪酶的特性

4.3 有机介质中的酶催化

4.3.1 有机介质中脂肪酶催化研究进展

4.3.2 非水相酶催化反应的特点

4.3.3 水对非水相酶催化反应的影响

4.3.4 有机溶剂对非水相酶催化的影响

4.3.5 反应底物对非水相酶催化的影响

4.3.6 温度对非水相酶催化的影响

4.3.7 反应时间对非水相酶催化的影响

4.3.8 摇床振荡速度对非水相酶催化的影响

4.3.9 酶用量对非水相酶催化的影响

5 糖酯合成概述

6 本论文的研究思路和主要研究内容

6.1 研究思路

6.2 主要研究内容

参考文献

第二章芒果苷的生物药剂学性质研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2.1 主要实验仪器

2.2 材料与试剂

3 实验部分

3.1 不同pH 缓冲溶液的配制

3.2

3.2.2 线性关系考察

3.2.3 方法学验证

3.3 MGF 在不同pH 溶液中平衡溶解度的测定

3.4 MGF 油水分配系数的测定

3.4.1 MGF 正辛醇饱和溶液的制备

3.4.2 正辛醇饱和水溶液的制备

3.4.3 油水分配系数的测定

4 结果与讨论

4.1 HPLC 法测定MGF 含量

4.1.1 测定波长选择

4.1.2 流动相选择

4.1.3 线性关系

4.2 MGF 在不同pH 溶液中平衡溶解度

4.3 MGF 的油水分配系数

4.4 MGF 的BCS 性质及分类

4.4.1 MGF 的溶解性低

4.4.2 MGF 的通透性低

5 本章小结

5.1 MGF 溶解度低

5.2 MGF 溶解度随pH 增加而增大

5.3 MGF 油水分配系数小

5.4 MGF 属于低溶解性-低通透性的药物

5.5 提高MGF 的脂溶性很重要

参考文献

第三章芒果苷糖酯衍生物的设计与合成

1 引言

2 实验仪器与材料

2.1 仪器

2.2 材料与试剂

3 实验流程

4 实验部分

4.1 有机溶剂脱水

4.2 酶催化反应

4.3 薄层色谱监测

4.4 液相色谱监测

4.5 产物HPLC-MS 分析

4.5.1 MS 质谱参数

4.5.2 HPLC 色谱条件

5 结果与讨论

5.1 酶促反应条件的选择

5.2 反应过程的TLC 监测

5.3 反应过程的HPLC 监测

5.3.1 HPLC 检测条件的确定

5.3.1.1 检测波长的确定

5.3.1.2 流动相的选择

5.3.2 酰基供体为甲酸乙酯的反应液

5.3.3 酰基供体为乙酸乙酯的反应液

5.3.4 酰基供体为丙酸乙酯的反应液

5.3.5 酰基供体为丁酸乙酯、苯甲酸甲酯

5.4 产物的HPLC-MS/MS 分析

5.4.1 甲酰基MGF

5.4.2 乙酰基MGF

5.4.3 丙酰基MGF

5.5 产物稳定性考察

5.5.1 甲酰基MGF 稳定性

5.5.2 乙酰基MGF 稳定性

5.5.3 丙酰基MGF 稳定性

6 本章小结

6.1 成功合成甲酰基MGF、乙酰基MGF、丙酰基MGF

6.2 酰基供体C 原子数目影响脂肪酶催化转酯化效率

6.3 MGF 酰基化衍生物的脂溶性均增加

6.4 选择丙酰基MGF 作为下一步研究对象

参考文献

第四章非水相酶促合成6′-O-丙酰基芒果苷的研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2.1 仪器

2.2 试剂与材料

3 实验部分

3.1 有机溶剂的脱水

3.2 酶法合成

3.3 液相色谱检测

3.4 产物结构鉴定

3.4.1 HPLC-MS 测定

3.4.2 NMR 测定

3.5 产物分离纯化

3.5.1 制备液相色谱条件

3.5.2 产物分离纯化流程

3.6 酶的重复利用

4 结果与讨论

4.1 脂肪酶的选择

4.2 反应溶剂的选择

4.3 加酶量对反应的影响

4.4 反应温度的选择

4.5 反应时间的确定

4.6 MGF 用量对合成的影响

4.7 丙酸乙酯用量对合成的影响

4.8 酶的重复利用对反应的影响

4.9 转速对反应的影响

4.10 水对反应的影响

4.11 产物结构确证

4.11.1 质谱

4.11.2 核磁共振光谱

5 本章小结

参考文献

第五章 6′-O-丙酰基芒果苷的理化性质和稳定性研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2.1 仪器

2.2 材料与试剂

3 实验部分

3.1 pH 缓冲溶液的配制

3.2 HPLC 测定PMGF

3.2.1 色谱条件

3.2.2 非生物样品中的含量测定方法学考察

3.2.3 血浆中的含量测定方法学考察

3.3 HPLC 测定MGF

3.3.1 色谱条件

3.3.2 非生物样品中的含量测定方法学考察

3.3.3 血浆中的含量测定方法学考察

3.4 PMGF 溶解度测定

3.5 PMGF 油水分配系数的测定

3.5.1 PMGF 正辛醇饱和溶液的制备

3.5.2 正辛醇饱和水溶液的制备

3.5.3 油水分配系数的测定

3.6 MGF 及PMGF 体外水解稳定性对比研究

3.6.1 MGF 及PMGF 在不同pH 溶液中的稳定性对比

3.6.2 MGF 及PMGF 人血浆中稳定性对比

4 结果与讨论

4.1 HPLC 测定PMGF 含量

4.1.1 非生物样品的HPLC 测定

4.1.2 血浆样品的HPLC 测定

4.2 HPLC 测定MGF

4.2.1 非生物样品中的HPLC 测定

4.2.2 血浆样品的HPLC 测定

4.3 PMGF 溶解度测定

4.4 PMGF 油水分配系数的测定

4.5 MGF 及PMGF 体外水解稳定性对比研究

4.5.1 MGF 及PMGF 在不同pH 缓冲溶液中的稳定性对比

4.5.2 MGF 及PMGF 人血浆中稳定性对比研究

5 本章小结

5.1 PMGF 溶解度与MGF 相近，并未显著降低

5.2 PMGF 油水分配系数显著提高

5.3 PMGF 在体外及血浆中均能水解为MGF

参考文献

第六章离体培养人肠菌群对MGF 及PMGF 的代谢研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2.1 仪器

2.2 试剂与材料

3 实验部分

3.1 TSB 培养基的配制

3.2 药物溶液的配制

3.3 人肠道菌培养液的制备

3.4 离体厌氧培养人肠道菌对MGF 的代谢

3.5 离体厌氧培养人肠道菌对PMGF 的代谢

3.6 肠菌群培养液的HPLC 监测

3.6.1 色谱条件

3.6.2 PMGF 的HPLC 测定

3.6.3 MGF 的HPLC 测定

3.7 代谢产物的分离和纯化

3.8 代谢产物的鉴定

3.8.1 HPLC-MS 分析

3.8.2 NMR 分析

4 结果与讨论

4.1 HPLC 测定MGF 及PMGF 的含量

4.1.1 HPLC 测定PMGF 含量

4.1.2 HPLC 测定MGF 含量

4.2 含药肠菌群培养液的HPLC 监测

4.3 代谢产物的结构鉴定

4.3.1 代谢产物HPLC-MS 分析

4.3.2 代谢产物 NMR 分析

4.4 离体厌氧培养人肠道菌对MGF 的代谢

4.5 离体厌氧培养人肠道菌对PMGF 的代谢

5 本章小结

5.1 MGF 在肠道菌群作用下代谢为苷元（Norathyriol）

5.2 PMGF 在肠道菌群作用下先水解为MGF 再代谢为Norathyri

5.3 两者代谢特征相近

5.4 Norathyriol 的口服吸收机制及药效有待研究

参考文献

第七章芒果苷及6′-O-丙酰基芒果苷抗炎活性研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2.1 实验仪器

2.2 实验材料

3 实验部分

3.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验

3.1.1 分组及给药方法

3.1.2 观察指标

3.2 MGF 及PMGF 对小鼠巨噬细胞炎性介质的影响

3.2.1 药品溶液的配制

3.2.2 RAW264.7 细胞的培养与传代

3.2.3 药物对RAW264.7 细胞释放炎性细胞因子的影响

3.2.4 IL-1 和TNF-α的测定（ELISA 法）

3.2.5 NO 的测定（Griess 法）

3.3 统计学处理

4 结果与讨论

4.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀度实验结果

4.2 MGF 及PMGF 对小鼠巨噬细胞炎性介质的影响

5 本章小结

5.1 MGF 及PMGF 在动物体内有显著抗炎作用

5.2 低浓度MGF 及PMGF 体外对NO、IL-1、TNF-α无抑制作用

5.3 MGF/PMGF 可能存在其他抗炎机制抑或代谢产物有抗炎作用

参考文献

全文总结

致谢

综述

参考文献

攻读学位期间发表学术论文

芒果苷糖酯衍生物的非水相酶促合成及其抗炎活性研究

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