论文摘要
目的检测胰腺癌中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达和微血管密度（microvessel density,MVD）,分析其相关性。构建VEGF基因siRNA表达载体,研究RNA干扰（ RNA interference,RNAi ）对胰腺癌细胞VEGF基因表达的抑制作用,为将来进一步研究VEGF在胰腺癌中的生物学功能及胰腺癌抗血管生成治疗提供基础。方法利用免疫组织化学方法检测22例胰腺癌组织中VEGF的表达和微血管密度,并以相应正常胰腺组织作为对照,比较两组间的差异。设计一对针对VEGF基因的小干扰RNA（ small interfering RNA, siRNA ）序列,并根据该序列合成两条小发夹RNA（ small hairpin RNA, shRNA ）的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制性酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。经PCR和测序的方法鉴定重组质粒是否构建成功。通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒和阴性对照质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418筛选4周后以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因,用荧光显微镜观察质粒表达效率。挑选阳性单克隆继续在G418压力下扩大培养4周后,再以GFP基因为报告基因,用流式细胞仪和荧光显微镜观察质粒表达效率。实时定量PCR（RQ-PCR）检测VEGF基因表达变化,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫细胞化学染色法检测VEGF基因在蛋白水平的表达变化。MTT比色法检测VEGF基因被干扰后对Panc-1细胞生长增殖的影响。结果①22例胰腺癌组织中VEGF阳性率77.3%,正常胰腺组织中VEGF阳性率27.3%,两者差异有统计学意义。22例胰腺癌组织的MVD值35.6±3.1,正常胰腺组织的MVD值15.2±2.9,两者差异有统计学意义。VEGF阳性表达与MVD呈正相关（ r =0.815, P<0.01 ）。②经PCR及测序鉴定确定重组质粒构建成功。③重组质粒转染Panc-1细胞后,VEGF基因表达被有效地抑制,干扰效率为77.37%,VEGF蛋白的抑制效率为44.66%。免疫细胞化学染色对照组VEGF呈强阳性染色,而转染重组质粒的实验组VEGF呈弱阳性染色。④MTT法显示,转染重组质粒的实验组与对照组相比,增殖率下降（P<0.01）。结论胰腺癌组织VEGF表达增强,且MVD明显高于正常胰腺组织,VEGF与MVD两者呈正相关。实时定量PCR技术能够快速、灵敏、方便地检测VEGF基因表达,且避免了污染。阳离子脂质体在贴壁细胞转染中显示出稳定、高效和低毒的特点。成功构建了VEGF的干扰质粒。VEGF siRNA表达质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞VEGF基因的表达。同时,Panc-1细胞的增殖率下降。提示VEGF基因可以作为胰腺癌抗血管生成治疗的靶点,RNA干扰是肿瘤基因治疗的有效手段。然而,将siRNA安全的导入人类细胞仍然是一个有待解决的重要问题。