Wnt/β-catenin信号通路对猪肌卫星细胞增殖分化影响的初步研究

论文摘要

骨骼肌组织中的成肌细胞是以肌卫星细胞的形式而存在,是肌肉组织的前体细胞,在骨骼肌的生长、发育、损伤及移植中具有重要作用。研究如何有效控制肌卫星细胞的分化,使骨骼肌朝着良性发展具有很重要的实践意义。Wnt蛋白是一种由Wnt基因编码的分泌型蛋白,通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合,激活细胞内信号通路,调节靶基因的表达,调控胚胎的早期发育,而且与细胞极性建立、细胞命运决定等多个发育事件有关。此外,它在高等动物的胚胎发育过程中主要参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等。Wnt信号在胚胎发生中肌肉形成过程中是必要的,是肌细胞终末分化和卫星细胞定向的关键调控因子。Wnt10b能特异性的调控肌细胞和再生肌肉的生脂潜能,并且激活Wnt10b可以抑制脂肪细胞分化。本试验以初生健康长白仔猪为试验动物,采用RT-PCR技术成功克隆猪Wnt10b基因与Wnt/β-catenin信号通路关键因子TCF4;分离培养骨骼肌肌卫星细胞,Wnt/β-catenin信号通路激活剂25mM LiCl处理,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色、HE染色、半定量RT-PCR和Western Blot等方法,研究Wnt/β-catenin信号通路对肌卫星细胞增殖分化的影响,并对其机理进行初步探讨。主要获得以下研究结果:1.克隆了猪Wnt10b基因部分CDS序列1190bp,包含起始密码子ATG。向GenBank提交,获得登录号EU181371,并对其进行生物信息学分析,发现与GenBank上已公布的人、小鼠、大鼠、牛、马和黑猩猩核苷酸的同源性分别为94%、89%、89%、92%、93%和92%;氨基酸同源性分别为98%、96%、96%、94%、98%和97%。表明该基因在不同物种间具有很高的保守性。该段基因编码394个氨基酸,具有Wnt家族保守的WNT1功能结构域和糖基化位点。2. RT-PCR检测Wnt10b在猪不同组织中的表达差异,结果表明该基因在猪肝脏中表达量最高,心脏、肌肉组织、皮下脂肪以及脾脏中也表达。3.成功克隆Wnt/β-catenin通路关键因子TCF4基因全长CDS序列2015bp,提交GenBank获得登录号EU694100。与GenBank上已公布的人、小鼠、大鼠、猕猴、牛和马的TCF4基因进行比对,同源性依次为94 %、90%、89%、93%、93%和95%。生物信息学分析发现开放式阅读框位于1-1281位。4. 25mM Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理猪骨胳肌细胞,发现能促进骨骼肌细胞的成肌分化,而且发现随着成肌分化的进行,β-catenin蛋白的表达量逐渐上升。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 成肌细胞的分化调控
• 1.1 成肌细胞的来源
• 1.2 成肌细胞分化的基本过程
• 1.2.1 成肌表型分化
• 1.2.2 肌分化过程中的细胞凋亡
• 1.3 几种重要的肌决定因子
• 1.3.1 成肌特异的bHLH转录因子
• 1.3.2 其他重要的成肌调节因子
• 1.3.3 其他参与调控成肌过程的因子
• 第二章 WNT/BETA-CATENIN信号通路的研究进展
• 2.1 WNT及其信号转导通路
• 2.1.1 Wnts
• 2.1.2 Wnt信号途径
• 2.1.3 Wnt信号的网络效应
• 2.2 WNT信号途径与骨骼肌发育
• 2.3 WNT信号途径与成脂分化
• 2.4 WNT信号途径与成骨分化
• 第三章 生物信息学在研究基因功能上的应用
• 3.1 核酸序列的预测
• 3.1.1 序列片段的拼接
• 3.1.2 核酸序列的同源性检索
• 3.1.3 比较基因组分析
• 3.1.4 利用Unigene数据库进行电子克隆
• 3.1.5 cDNA序列的开放阅读框分析
• 3.1.6 基于核酸序列的电子基因定位
• 3.1.7 基因电子表达谱分析
• 3.1.8 分子进化的研究
• 3.1.9 较长或全长的cDNA序列注册
• 3.2 针对蛋白质的预测
• 3.2.1 序列同源性分析
• 3.2.2 从氨基酸组成辨识蛋白质
• 3.2.3 预测蛋白质的物理性质
• 3.2.4 蛋白质二级结构预测
• 3.2.5 其它特殊局部结构
• 3.2.6 蛋白质的三级结构
• 试验研究
• 前言
• 第四章 猪WNT10B基因CDNA的克隆及组织表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 RNA提取
• 4.1.3 反转录
• 4.1.4 PCR扩增
• 4.1.5 扩增片段的分离和克隆
• 4.1.6 克隆产物的筛选与鉴定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 肌肉组织提取RNA的完整性
• 4.2.2 RT-PCR结果
• 4.2.3 重组质粒的PCR鉴定
• 4.2.4 克隆所得序列、Genbank登陆号及同源性比对分析
• 4.2.5 各组织Wnt10b基因mRNA表达丰度的差异性检验
• 4.3 讨论
• 第五章 猪WNT10B基因的生物信息学分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Wnt10b基因序列的基本分析
• 5.2.2 猪Wnt10b基因编码蛋白结构与功能预测
• 5.2.3 系统进化分析
• 5.3 讨论
• 第六章 猪TCF4基因全长CDS的克隆
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料和试剂
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 肌肉组织RNA的完整性
• 6.2.2 RT-PCR结果
• 6.2.3 重组质粒的PCR鉴定
• 6.2.4 克隆所得序列、GenBank登陆号及同源性比对分析
• 6.2.5 开放阅读框的识别
• 6.3 讨论
• 第七章 LICL对猪肌卫星细胞增殖分化的影响
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.2 试验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 肌卫星细胞的鉴定
• 7.2.2 LiCl处理后肌卫星细胞的形态学变化
• 7.2.3 LiCl对猪肌卫星细胞增殖的影响
• 7.2.4 RT-PCR检测LiCl对猪成肌分化标志基因的影响
• 7.2.5 LiCl处理后肌卫星细胞β-catenin蛋白的表达
• 7.3 讨论
• 结论
• 有待于进一步完善或深入研究的问题
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介