去甲斑蝥素在巨噬细胞介导的固有免疫应答中的功能及作用机制研究

论文摘要

斑蝥素（Cantharidin）是从中药斑蝥中提取的一种有效活性成分,可用于治疗原发性肝癌、乳腺癌、胃癌等多种癌症。但是斑蝥素较高的毒性以及对泌尿系统的严重刺激极大限制了其临床应用。去甲斑蝥素（Norcantharidin）属于斑蝥素的衍生物,在保持药物活性的同时极大降低了毒性作用以及对泌尿系统的刺激,目前主要用于肝癌、食管癌及胃癌等多种癌症的治疗,具有较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用。迄今为止,对于去甲斑蝥素的研究主要专注于其抗肿瘤的活性。虽然已开发出部分药品用于临床肿瘤治疗,然而,对于去甲斑蝥素在机体免疫功能方面的作用仍仅限于其促进白细胞升高作用,对详细的免疫调控功能和分子机制未见报道。免疫系统是保护人体健康、维护自身稳定的重要屏障,免疫监视和防御功能的缺失是造成肿瘤发生和疾病感染的重要原因之一。然而研究表明,在肿瘤的治疗过程中,患者的免疫力经常受到化疗药物的显著抑制,从而容易诱发感染及其它并发症；同时,免疫功能的抑制也会显著降低机体自身清除肿瘤细胞的能力。由此可见,在肿瘤治疗过程中提高机体免疫力能够有助于患者获得更好的治疗效果。因此,本研究选取某些已证明具有抗肿瘤活性的小分子化合物,以巨噬细胞为研究模型筛选具有免疫调节作用的药物。首先,为了获得毒性较小、对细胞和机体损伤较低的化合物,我们通过MTS法检测候选化合物对巨噬细胞生长状况的影响。同时,由于细胞因子的分泌是免疫应答过程中的重要功能,我们利用RT-PCR检测候选化合物对固有免疫相关细胞因子（包括TNF-a,IL-6,iNOS,MCP-1等）的表达的影响。结果显示,去甲斑蝥素对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的毒性明显低于其它候选化合物,并具有较好的促进细胞因子表达的作用。在上述工作基础之上,我们利用Real-time PCR在mRNA水平上进一步验证了NCTD对巨噬细胞分泌细胞因子促进作用。进而我们通过ELISA证明,在骨髓诱导巨噬细胞及RAW264.7细胞中,NCTD确实能够在蛋白水平提高巨噬细胞的细胞因子表达及分泌。这些结果显示,相比其它化合物,去甲斑蝥素对免疫系统的毒副作用较低并可能具有提高机体免疫应答的功能。巨噬细胞是固有免疫发生过程中必不可少的一类免疫细胞,它通过多种途径参与免疫应答的过程。因此,为了系统研究NCTD对巨噬细胞所介导的固有免疫功能的调控作用,我们在RAW264.7细胞和腹腔巨噬细胞中对一氧化氮的分泌、病原体吞噬及金属基质蛋白酶的表达做了进一步检测,结果发现随着加药浓度的增加,巨噬细胞所介导的这些免疫功能均有所提高。为进一步评价NCTD对机体免疫功能的整体调控作用,我们在小鼠急性腹膜炎动物模型中,对NCTD的提高机体免疫应答、抵抗感染能力进行了评价,结果显示NCTD可以在小鼠腹腔感染模型中提高机体清除病原体、抵抗感染的能力,并明显提高了小鼠的存活率,提示我们NCTD潜在的免疫促进作用。Toll样受体家族成员4（Toll-like receptor4）是固有免疫系统识别革兰氏阴性菌病原体模式分子LPS的重要受体,其所激活的下游信号通路直接参与了机体抗感染免疫的功能。因此我们采用LPS刺激小鼠巨噬细胞,模拟病原体感染机体的过程,对NCTD所参与调控的分子机制进行研究。MAPK以及NF-κB相关信号通路在免疫应答过程中发挥了十分重要的作用,也是TLR下游的关键信号通路。因此,我们针对这两条信号通路中的关键蛋白p65, p38, JNK, ERK1/2, AKT开展了系统的研究。结果发现随着加药浓度的增加,AKT以及p65的磷酸化水平有所上升,而调控细胞增殖分化的核转录因子NF-κB的入核现象有所增加,EMSA结果表明NF-κB的转录活性也有所增强,提示NCTD提高巨噬细胞免疫应答水平的作用是通过调节AKT/NF-κB相关信号通路来实现的。以上实验表明：1. NCTD能够调节巨噬细胞介导的固有免疫应答,提高巨噬细胞的免疫应答水平。2. NCTD能够提高机体抗感染的能力,保护机体免受病原体微生物侵袭。3. NCTD提高免疫能力的作用可能是通过促进AKT/p65/NF-κB相关信号通路来完成的。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1. 固有免疫系统是维护自身稳定、抵御病原体侵害的重要屏障
• 2. 去甲斑蝥素具有显著的抗肿瘤作用
• 3. 机体免疫能力的提高对于肿瘤治疗具有重要的意义
• 第一部分 材料方法
• 1. 试剂及药物
• 2. 仪器
• 3. 实验方法
• 第二部分 实验结果
• 1. 筛选模型确立及初筛结果
• 1.1 前言
• 1.2 实验结果与讨论
• 1.3 小结
• 2. 去甲斑蝥素对巨噬细胞免疫功能的影响
• 2.1 前言
• 2.2 实验结果与讨论
• 2.3 小结
• 3. 小鼠急性腹膜炎模型建立及去甲斑蝥素的调节作用
• 3.1 前言
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.3 小结
• 4. 去甲斑蝥素提高巨噬细胞免疫应答水平的信号通路研究结果
• 4.1 前言
• 4.2 实验结果与讨论
• 4.3 小结
• 第三部分 结语
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢