定向进化E.coli芳香族氨基酸转氨酶提高催化DL-高苯丙氨酸与D-正亮氨酸的活力

论文摘要

化学合成非天然氨基酸的过程复杂,毒性较大,而微生物转化法具有较高的立体选择性,生产过程也较简化,反应更安全。转氨酶以其底物特异性低,反应速度快,产物易分离等优点为非天然氨基酸的生产提供了一条较好的途径。然而,非天然氨基酸不是转氨酶的天然底物,对非天然氨基酸的催化活性低。本课题采用定向进化的策略,通过易错PCR的方法构建大肠杆菌芳香族氨基酸转氨酶基因的突变文库,使用非天然氨基酸作为唯一氮源筛选对D,L-高苯丙氨酸和D-正亮氨酸具有高催化活性的突变菌株,为后续非天然氨基酸的生产打下基础。以实验室构建的pET23a-tyrB质粒为模板,进行4轮易错PCR扩增。将扩增后的基因亚克隆到高表达载体pET23a上,转化E.coli BL21（DE3）,形成pET23a-tyrB转E.coli BL21（DE3）突变库。将突变文库接入分别以5mmol/L D,L-高苯丙氨酸或10mmol/LD正亮氨酸为唯一氮源的M9培养基中,以相同含量的未突变的pET23a-tyrB E.coli BL21（DE3）转化子和pET23a E.coli BL21（DE3）转化子作对照。待菌长出后,通过3轮转接,并逐步降低培养基中非氨基酸的含量。在该筛选压力下,在含1mmol/L D,L高苯丙氨酸的培养基中培养70h,四管中的两管突变型培养物的OD600是野生型的3倍。将该突变菌株涂布含5mmol/L D,L-高苯丙氨酸的M9平板获得单菌落,任意挑取50个单菌落接种于0.5mmol/L D,L-高苯丙氨酸的筛选培养基,得到H-3,H-14,H-20,H-26,H-28,H-36, H-377个高活性的细菌克隆。利用同样的方法,在2mmol/L D-正亮氨酸作氮源的培养条件下培养80h,野生型和空载型的OD600值变化很小,而突变型的OD600值增大7倍。涂布含5mmol/L D-正亮氨酸的M9平板后获得单菌落,任意挑取50个单菌落接种于1mmol/L D-正亮氨酸的筛选培养基,得到N-2,N-12,N-19,N-20,N-22,N-25,N-267个高活性的细菌克隆。利用转氨酶与谷氨酸脱氢酶的偶联反应复筛,筛选到高效催化D,L-高苯丙氨酸转氨反应的5个突变克隆H-3,H-14,H-20,H-36,H-37,筛选到高效催化D-正亮氨酸转氨反应的4个突变克隆N-2,N-12,N-19,N-20。薄层层析分析等量的突变型H-14和野生型粗酶液催化转氨反应后的生成物,将生成物谷氨酸从硅胶板上切割下来用茚三酮反应定量。发现突变型酶H-14催化D,L-高苯丙氨酸生成的谷氨酸是野生型的5.0倍；突变型酶N-19催化D-正亮氨酸生成的谷氨酸是野生型酶的14.6倍。将筛选到的突变单克隆测序,发现H-3和H-37的tyrB基因的突变位点一致,H-14和H-36的tyrB基因的突变位点一致。所有9个克隆H-3,H-14,H-20,H-36,H-37, N-2,N-12,N-19,N-2中tyrB基因有3个共同的突变位点A135G,T629G,T843C,但是其中A135G和T843C是沉默突变,对应的氨基酸突变为Gln45Gln和Arg281Arg,仅仅是T629G导致210位的Phe突变为Cys。H-14,H-20的tyrB基因有共同的突变位点G433A,T488A,对应的氨基酸突变为Val145Met,Leu163Gln。对D,L-高苯丙氨酸催化活力最高的突变菌株H-14的tyrB基因特有的突变位点有T322G, T665C, C688T, C712A, A728G, T1076C。对应的氨基酸突变为Leu108Val, Met222Thr, Arg230Cys, Pro238Thr, Asn243Ser,Val359Ala。N-2, N-19,N-20的tyrB基因共同的突变位点A439T,对应的氨基酸突变为Thr147Ser。对D-正亮氨酸催化活力最高的突变菌株N-19的tyrB基因特有的突变位点有A65T, A158G, A209G, A496T, T524A, A556G, T569C, A637G, T686C, A1022G。对应的氨基酸突变为Glu22Val, Glu53Gly, Glu70Gly, Thr166Ser, Ile175Asn, Thr186Ala, Leu190Pro, Ile213Val, Ile229Thr, Phe339Val。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词与符号
• 第一部分 研究背景
• 1 转氨酶简介
• 1.1 芳香族氨基酸转氨酶的序列及结构特点
• 2 手性药物与非天然氨基酸
• 2.1 手性药物
• 2.2 非天然氨基酸
• 2.3 非天然氨基酸的合成
• 3 酶的定向进化
• 3.1 易错PCR
• 3.2 DNA改组和外显子改组
• 3.3 随机引物体外重组
• 3.4 交错延伸
• 4 文库的筛选
• 5 偶联反应的酶学性质测定
• 6 本文研究的内容、目的及意义
• 第二部分 实验研究
• 1 实验材料,仪器与试剂
• 1.1 实验菌株与载体
• 1.2 主要仪器与设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 所用培养基及配制
• 1.5 主要溶液及其配制
• 2 实验方法
• 2.1 易错PCR扩增与突变文库的构建
• 2.2 阳性克隆的筛选与鉴定
• 2.3 定量比较突变型与野生型粗酶液的催化活力
• 2.4 在不同的pH和温度下的酶活力检测
• 2.5 突变型转氨酶的序列和突变位点分析
• 3 结果与分析
• 3.1 易错PCR条件的确定
• 3.2 基因扩增和突变体文库的构建
• 3.3 阳性突变株的筛选和鉴定
• 3.4 定量比较突变型与野生型粗酶液的催化活力
• 3.5 芳香族氨基酸转氨酶在不同pH和温度下的活力检测
• 3.6 突变转氨酶的序列分析和突变位点分析
• 第三部分 讨论与展望
• 1 讨论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢