共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和猪瘟病毒E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）的GP5蛋白是PRRSV最重要的结构蛋白之一,可诱导机体产生中和抗体并具有很强的中和病毒活性,而且还可刺激机体产生细胞免疫,是研制新型疫苗的首选靶蛋白。猪瘟病毒（classical swine rever virus,CSFV）E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要结构蛋白之一,能诱导机体产生中和抗体和保护性免疫应答,因此,E2蛋白是开发猪瘟新型疫苗、诊断试剂及研究CSFV致病机理的重要靶蛋白。“自杀性”DNA疫苗（suicidal DNA vaccine）是基于常规DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗（self-replicating RNA vaccine）基础上发展起来的一种新型疫苗,不仅具有“自主复制型”RNA疫苗的安全性与高效性,而且结合了常规DNA疫苗制备简单、保存方便等优点,这使其成为目前核酸疫苗研究的热点。为了获得新型双价“自杀性”DNA疫苗,将PRRSV GP5基因克隆于此前构建的表达CSFV E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位（PADRE）,在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒（PrV）UL49基因,获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELlSA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能发生特异性的淋巴细胞增殖;部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。这表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
• 1.2 猪瘟研究进展
• 1.3 "自杀性"DNA疫苗的简介
• 1.4 VP22和泛DR表位简介
• 1.5 本研究目的意义
• 材料与方法
• 材料
• 1.1 毒株、细胞与菌种
• 1.2 载体与质粒
• 1.3 单克隆抗体和重组蛋白
• 1.4 工具酶与试剂
• 1.5 主要试验仪器
• 1.6 试验动物
• 材料
• 2.1 PRRSV GP5基因的PCR扩增和克隆
• 2.2 重组质粒构建
• 2.3 重组质粒鉴定
• 2.4 重组质粒在293T细胞中的瞬时表达
• 2.5 重组质粒的大量提取
• 2.6 动物分组及DNA免疫接种
• 2.7 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定
• 2.8 用WST-8试剂检测小鼠脾淋巴细胞增殖
• 2.9 用CFSE染色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖
• 2.10 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平的ELISA检测
• 结果
• 1 目的基因的PCR扩增
• 2 重组质粒的酶切鉴定
• 3 外源基因在瞬时转染细胞中的表达
• 4 免疫小鼠血清特异性抗体的检测
• 5 免疫小鼠的特异性淋巴细胞增殖水平
• 6 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢