鱿鱼墨黑色素及黑色素铁生物活性的研究

论文摘要

鱿鱼墨是鱿鱼加工过程中的废弃物,其主要化学成分是黑色素和蛋白多糖复合体。研究表明鱿鱼墨具有抗肿瘤、调节机体免疫功能、诱导多种细胞因子等生理活性,并一直认为其主要的活性成分为多肽片断、酸性多糖、酪氨酸酶以及微量元素。黑色素是以吲哚结构为主体的异聚物,能作为自由基的接受体而阻断自由基连锁反应,且能螯合多种金属离子。目前国内外对鱿鱼墨黑色素的研究多集中于其结构和理化性质,有关其生物活性的报道较少。为了系统评价鱿鱼墨黑色素的营养及药用功效,进一步合理开发利用鱿鱼墨提供理论依据,本文从鱿鱼墨中提取了高纯度黑色素,进一步降解制备了水溶性黑色素,并利用其螯合特性制备了黑色素螯合铁,并对其生物活性进行了研究。通过连续皮下注射氢化可的松建立小鼠免疫机能低下模型,以不同剂量的鱿鱼墨不溶性黑色素灌胃模型小鼠,探讨了鱿鱼墨不溶性黑色素对小鼠免疫机能的调节作用。结果表明,鱿鱼墨不溶性黑色素可显著提高免疫低下模型小鼠的脾及胸腺指数、血清溶血素含量(HC50),小鼠迟发性变态反应及脾淋巴细胞转化能力,显著促进小鼠NK细胞杀伤活力及巨噬细胞吞噬能力。提示鱿鱼墨不溶性黑色素对机体特异性及非特异.性免疫机能具有显著调节作用。以颈背部皮下注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型,通过灌胃不同剂量的鱿鱼墨不溶性黑色素,研究了鱿鱼墨不溶性黑色素的免疫调节作用。结果显示,鱿鱼墨不溶性黑色素能显著促进小鼠血清及肝脏中SOD和GSH-PX活力及皮肤中羟脯氨酸含量,降低MDA及脑脂褐质含量;提示鱿鱼墨不溶性黑色素具有显著的抗氧化、抗衰老功能。研究了鱿鱼墨不溶性黑色素对重金属的脱除作用。将小鼠随机分为正常组、黑色素组、重金属组、黑色素+重金属组。分别灌胃基础溶液、鱿鱼墨不溶性黑色素溶液、混合重金属溶液（Ba、Cd、Cr、Pb）鱿鱼墨不溶黑色素+混合重金属溶液。结果表明,与重金属组比较,黑色素+重金属组小鼠股骨、血样中重金属离子的含量显著降低,粪便中重金属排泄了显著升高,表明鱿鱼墨不溶性黑色素能有效阻碍食物中重金属离子在体内的吸收和累积,促进体内重金属离子排出体外,,减轻重金属对机体的危害。采用低铁饲料并辅以尾静脉定期放血法建立缺铁性贫血（Irondeficiency anemia,IDA）大鼠模型,灌胃不同剂量的鱿鱼墨黑色素铁。结果显示,鱿鱼墨黑色素铁能够显著提高IDA大鼠血红蛋白（Hb）含量、红细胞（RBC）数、红细胞压积（HCT）、红细胞平均体积（MCV）、血清铁（SI）含量,有效降低红细胞内游离原卟啉（FEP）浓度浓度,显著促进IDA大鼠贫血症状的恢复。鱿鱼墨黑色素铁对IDA大鼠红系造血具有促进作用。通过饲喂高脂饲料建立小鼠实验性高脂血症小鼠模型,研究了鱿鱼墨不溶性黑色素及水溶性黑色素对实验性高脂血症小鼠脂质代谢的调节作用及其机理。实验结果表明,鱿鱼墨不溶性黑色素及水溶性黑色素均能显著降低高胆固醇血症大鼠血清TC、TG、LDL-c含量及动脉粥样硬化指数（Atherosclerosis index,AI）（P＜0.05）;显著降低肝脏TC、TG含量;显著提高粪便中总脂质、胆固醇和胆汁酸的含量。并能显著提高肝脏中棕榈酰转移酶-1（Carnitine palmitoyltransterase-1,CPT-1）、β-过氧化物酶体（β-oxidationperoxisomal）和磷脂酸磷酸酶（Phosphatidic acidphophyhydrolase,PAP）的活力。提示鱿鱼墨黑色素及水溶性黑色素能有效改善添加胆固醇引起的脂质代谢紊乱,抑制脂质在消化道内的吸收,并促使其通过排泄途径排出体外。其主要作用机理是鱿鱼墨黑色素及水溶性黑色素能促进脂质在体内的β—氧化和异化作用。采用MTT法检测鱿鱼墨水溶性黑色素对H2O2损伤血管内皮细胞增殖活性的影响。结果表明鱿鱼墨水溶性黑色素能显著保护H2O2损伤血管内皮细胞的正常增殖,显著提高高脂血症小鼠血清中NO含量,提示其通过提高细胞的抗氧化能力,增强细胞膜的稳定性,对血管内皮细胞起到保护作用。选取4株具有代表性的肿瘤细胞,采用MTT法检测2种分子量的Me-W对不同肿瘤细胞株增殖活性的影响,结果表明,两种分子量的Me-W对悬浮生长的S180细胞均有显著抑制其增殖的作用,而对贴壁细胞Caco-2、Hela和B16增殖无显著性影响;分子量10～50Kda的Me-W对S180增殖的抑制作用显著优于分子量＞50Kda的Me-W。提示水溶性鱿鱼墨黑色素对肿瘤细胞的抑制作用有一定的选择性。其机理有待于进一步探讨。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述与立论依据
• 1 天然黑色素的研究概况
• 1.1 天然黑色素结构与的生成
• 1.2 黑色素的理化性质
• 1.2.1 黑色素的光吸收性质
• 1.2.2 黑色素的还原性
• 1.2.3 黑色素的阳离子螯合特性
• 1.3 黑色素的纯化和制备方法及对其性质的影响
• 1.3.1 水洗法
• 1.3.2 酸解法、碱解法（化学法）
• 1.3.3 酶解法
• 1.3.4 影响黑色素的制备的其他因素
• 1.4 黑色素的氧化降解及其定量研究
• 1.4.1 黑色素的降解途径及产物
• 1.4.2 黑色素的定量研究
• 1.5 黑色素的生物功效与应用
• 1.5.1 黑色素的光保护作用
• 1.5.2 黑色素的抗菌和抗病毒活性。
• 1.5.3 黑色素的抗氧化及抗衰老作用
• 1.5.4 其它作用
• 2 乌贼墨及鱿鱼墨黑色素研究现状
• 2.1 乌贼墨的体内合成
• 2.2 乌贼墨化学成分及性质的研究
• 2.3 乌贼墨的生物活性研究
• 2.3.1 乌贼墨的凝血活性
• 2.3.2 乌贼墨的抗肿瘤活性
• 2.3.3 乌贼墨的抗菌活性
• 2.3.4 乌贼墨升高白细胞作用
• 2.4 鱿鱼墨及鱿鱼墨黑色素研究概况
• 3 本研究立论依据
• 第二章 鱿鱼墨不溶性黑色素的免疫调节作用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法:
• 2 结果
• 2.1 对小鼠脾、胸腺/体重比值的影响
• 2.2 对小鼠血清溶血素水平的影响
• 2.3 对小鼠迟发型变态反应的影响
• 2.4 对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响
• 2.5 对小鼠NK细胞活力的影响
• 2.6 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 鱿鱼墨不溶性黑色素对亚急性衰老模型小鼠抗氧化能力的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 数据处理和统计学分析
• 2 结果
• 2.1 对D-半乳糖致衰老模型小鼠免疫器官重量的影响
• 2.2 对MDA含量的影响
• 2.3 对小鼠体内抗氧化酶活性的影响
• 2.4 对大脑脂褐质含量的影响
• 2.5 对皮肤中羟脯氨酸的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 鱿鱼墨不溶性黑色素对小鼠体内重金属的脱除作用
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 鱿鱼墨囊
• 1.3 主要实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 鱿鱼墨不溶性黑色素的制备
• 2.2 灌胃溶液的配制
• 2.3 动物分组及实验
• 2.4 小鼠粪便和股骨中重金属离子含量的测定
• 2.5 小鼠血液样品中重金属离子含量的测定
• 2.6 数据处理和统计学分析
• 4.结果
• 4.1 对小鼠血液、股骨及粪便中铅含量的影响
• 4.2 对小鼠血液、股骨及粪便中镉含量的影响
• 4.3 对小鼠小鼠血液、股骨及粪便中铬含量的影响
• 4.4 对小鼠血液、股骨及粪便中钡含量的影响
• 5 讨论
• 6 小结
• 第五章 鱿鱼墨黑色素铁对大鼠缺铁性贫血的治疗作用
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 鱿鱼墨
• 1.4 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 鱿鱼墨黑色素铁的制备
• 2.2 低铁饲料的配制
• 2.3 大鼠IDA模型的建立
• 2.4 动物分组及实验
• 2.5 外周血涂片的制作
• 2.6 一般血液学分析
• 2.7 血清铁（SI）含量测定
• 2.8 红细胞内游离原卟啉测定（FEP）
• 2.9 血清抗氧化指标的测定
• 2.10 数据处理和统计学分析
• 3 结果
• 3.1 大鼠IDA模型的建立
• 3.2 鱿鱼墨黑色素铁对IDA大鼠体重的影响
• 3.3 对IDA大鼠HB、RBC、HCT和MCV的影响
• 3.4 外周血细胞涂片
• 3.5 对IDA大鼠SI及FEP的影响
• 3.6 对IDA大鼠血清中GSH-PX、SOD活力及MDA含量的影响
• 4 讨论:
• 5 小结
• 第六章 鱿鱼墨黑色素对实验性高脂血症小鼠脂质代谢的调节作用
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 鱿鱼墨
• 1.3 主要试剂
• 1.4 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 鱿鱼墨不溶性黑色素制备
• 2.2 鱿鱼墨水溶性黑色素的制备
• 2.3 高脂饲料的配制
• 2.4 动物的分组及实验
• 2.5 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和NO含量测定
• 2.6 血清MDA,SOD及GSH-PX测定
• 2.7.肝脏脂质抽提
• 2.8 肝脏TC,TG含量测定
• 2.9 肝脏匀浆制备
• 2.10 肝脏MDA,SOD及GSH-PX测定
• 2.11 粪便脂质含量测定
• 2.12 肝脏脂质代谢相关酶活力测定
• 2.13 数据处理和统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 对大鼠体重和肝指数的影响
• 3.2 对血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响
• 3.3 对肝脏TC及TG含量的影响
• 3.4 对小鼠血清和肝脏中MDA含量、SOD和GSH-PX活性的影响
• 3.5 对小鼠血清NO含量的影响
• 3.6 对小鼠粪便中总脂质及胆固醇含量的影响
• 3.7 对小鼠粪便中胆汁酸含量的影响
• 3.8 对肝脏脂肪代谢相关酶活力的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第七章 鱿鱼墨水溶性黑色素对血管内皮细胞的保护作用
• 1 材料与方法
• 1.1 鱿鱼墨
• 1.2 细胞株
• 1.3 实验试剂
• 1.4 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 水溶性黑色素制备
• 2.2 水溶性黑色素对血管内皮细胞的保护作用
• 2.3 数据处理及统计学分析
• 3 结果
• 3.1 鱿鱼墨水溶性黑色素对内皮细胞增殖活性的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第八章 鱿鱼墨水溶性黑色素对肿瘤细胞增殖活性的影响
• 1 材料
• 1.1 水溶性黑色素
• 1.2 细胞株
• 1.3 实验试剂
• 1.4 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 对肿瘤细胞增殖的影响
• 2.3 数据处理及统计学分析
• 3 结果
• 3.1 对S180细胞增殖的影响（图14）
• 3.2 对HELA细胞增殖活性的影响（图15）
• 3.3 对CACO-2细胞增殖的影响（图16）
• 3.4 对B16细胞增殖的影响（图17）
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 本论文的创新点
• 今后努力的方向
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 参与专利
• 参与的科研项目
• 致谢