人类未成熟卵体外成熟培养、雌/雄原核形态学判别和原核期胚胎原核移植及其重构胚后续发育潜能的研究

论文摘要

研究背景:自体移植是当今最为看好的移植治疗模式。自体胚胎干细胞（ESCs）的自我增殖和多向分化潜能使其成为最有潜力的自体移植供体源。但是,自体ESCs的创建目前还存在明显的“低效率”问题,原因主要是供体细胞核重新编序不完全、重构卵细胞组分的种系特异性丢失、或缺少父源性或母源性基因印记的影响。如此,我们提出了《亲缘性基因印记校正的雌核发育/雄核发育技术创建人自体ESCs》的全面解决方案。该方案选用自体原核作为供体细胞核源,试图解决成体细胞核基因重新编程问题;该方案通过构建雌核发育/雄核发育自体重构胚,试图解决重构胚细胞组分缺失问题;该方案还通过对雌核发育/雄核发育自体重构胚进行基因印记方面的校正处理,试图解决基因印记缺失的问题。本研究就该方案的实施能否使用辅助生殖临床废弃的未成熟卵作为（ESCs研究用）卵源、如何活体判别人类原核的亲缘性（构建雌核发育/雄核发育方式原核期胚胎）以及相关的原核移植技术进行了系列的前期基础研究和探索。一、卵丘冠颗粒细胞剥除的人未成熟卵体外成熟培养和发育潜能的研究目的:1、了解卵丘冠颗粒细胞剥除的人未成熟卵（ccdlMOs）体外成熟培养（IVM）和相应受精卵植入前发育潜能。2、评估同步和个体化AutoMFF-IVM（自体成熟卵泡液辅助的IVM）培养系统和AutoMFF&CCs-coIVM（自体成熟卵泡液和自体卵丘冠颗粒细胞共同辅助的IVM）培养系统分别用于M-1期（第一次减数分裂中期）和GV期（第一次减数分裂前期）ccdIMOs的IVM,相应的IVM增进效果。方法:1、2004年11月-2005年7月间从151对[156个卵巢刺激周期实施卵浆内单精子注射（ICSI）治疗的]不孕夫妇获赠388个ccdIMOs。其中GV期卵196个,M-Ⅰ期卵192个。2、IVM标准方案使用MediCult IVM系统（Cat#:82214010,MediCult公司,丹麦）,微滴培养12-48小时（37C,5%CO2,饱和湿度）并作适当改良,作为IVM

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缩略词表

中文摘要

一、卵丘冠颗粒细胞剥除的人未成熟卵体外成熟培养和发育潜能的研究

二、人类原核形态学特征的亲缘学意义及其验证研究

三、人类原核期胚胎原核移植操作及其重构胚后续发育潜能的研究

英文摘要

Part Ⅰ: Study on in-vitro maturation of human corona-cumulus-denuded immature oocytes and the subsequent preimplantation embryo development

Part Ⅱ: Study on kinship significances of morphological characteristics of human pronuclei and their verification

Part Ⅲ: Study on pronucleus transfer in human zygotes and the subsequent preimplantation development of reconstructed embryos

1 研究背景

1.1 器官、组织移植或细胞替代治疗呼唤自体移植／替代治疗

1.2 自体ESCs是最有潜力的自体移植／替代治疗供体源

1.3 自体ESCs通过体细胞核移植或生殖细胞单性生殖技术创建

1.4 自体ESCs的创建还存在明显的“低效率”问题

1.5 自体ntESCs创建特征和低效率原因分析

1.6 自体生殖细胞单性生殖方式ESCs创建特征和低效率原因分析

1.7 提高自体ESCs创建效率的策略和方案

1.7.1 选用自体原核作为供体细胞核源，解决成体细胞核基因重新编程问题。

1.7.2 构建雌核发育／雄核发育自体重构胚，解决重构胚细胞组分缺失问题。

1.7.3 对雌核发育／雄核发育自体重构胚进行校正处理，解决基因印记问题。

图1-1 亲缘性基因印记校正的自体雌核发育原核期胚胎构建示意图

图1-2 亲缘性基因印记校正的自体雄核发育原核期胚胎构建示意图

图1-3 第一次减数分裂同源染色体分离，产生纺锤体和第一极体

2 人类卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵体外成熟培养和发育潜能的研究

2.1 材料和方法

2.1.1 未成熟卵的获取

2.1.2 IVM方案和具体的培养液制备方法

2.1.3 研究设计

2.1.4 具体的IVM处理

2.1.5 受精和胚胎培养

2.1.6 统计分析方法

2.2 结果

2.2.1 AutoMFF对AutoCCs生长的影响

2.2.2 不同未成熟卵类别和IVM方案诸IVM时段成熟率及比较

2.2.3 不同类别和IVM方案成熟卵和体内自然成熟卵ICSI受精和发育潜能比较

表2-1 不孕妇女的一般临床特征

表2-2 不同IVM方案不同时段GV期和M-I期ccdIMOs成熟率及比较

表2-3 不同类别和IVM方案成熟卵和体内自然成熟卵ICSI受精和发育潜能比较

图2-1 卵核成熟的主要阶段

图2-2 用于ccdIMOs的AutoMFF-IVM技术和AutoMFF&CCs-coIVM技术

图2-3 追加或不追加AutoMFF相应autoCCs不同培养时段的饲养层样生长

图2-4 不同类别ccdIMOs不同IVM时段累积成熟率及比较

图2-5 M1期ccdIMOs不同IVM方案不同时段相应IVM效果及比较

图2-6 GV期ccdIMOs不同IVM方案不同时段相应IVM效果及比较

图2-7 体外IVM成熟卵和体内自然成熟卵ICSI受精率、发育潜能及比较

2.3 讨论

2.3.1 人卵巢刺激周期获取的ccdIMOs体外培养成熟规律

2.3.2 人卵巢刺激周期获取的ccdIMOs体外培养成熟后受精和发育潜能

2.3.3 AutoMFF和AutoCCs参与的同步／个体化ccdIMOs IVM及其价值

2.4 小结

3 人类原核形态学特征的亲缘学意义及其验证研究

3.1 材料和方法

3.1.1 研究用卵和精子的获取

3.1.2 ccdIMOs的体外成熟培养（IVM）

3.1.3 2Sperm-ICSI构建三原核胚胎模型

3.1.4 研究设计和统计分析方法

3.2 结果

3.2.1 ccdIMOs体外培养成熟卵2Sperm-ICSI创建三原核胚胎模型的效果

3.2.2 人原核亲缘性活体判别形态学标准对三原核胚胎模型原核亲缘性的判别效果

图3-1 两性生殖原核期胚胎原核亲缘性的形态学特征

3.3 讨论

3.3.1 ccdIMOs体外培养成熟卵2Sperm-ICSI创建三原核胚胎模型的效果

3.3.2 人2Sperm-ICSI三原核胚胎模型在人原核亲缘性形态学判别研究的意义

3.3.3 人类原核形态学特征的亲缘学意义

3.4 小结

4 人类原核期胚胎原核移植及其重构胚后续发育潜能的研究

4.1 材料和方法

4.1.1 研究用原核期胚胎的获取

4.1.2 人两性生殖原核期胚胎原核亲缘性判别的形态学标准

4.1.3 原核期胚胎原核移植显微操作

4.1.4 原核期胚胎的植入前培养和观察

4.1.5 研究设计和统计分析方法

4.2 结果

4.2.1 人多原核胚胎选择性原核减灭术（SPnR）及其后的植入前发育

4.2.2 人原核期胚胎原核移植（SPnR／ICPI方式）重构及其后的植入前发育

图4-1 多原核胚胎选择性原核减灭术及其后的植入前发育

图4-2 原核期胚胎原核移植（SPnR／ICPI方式）及其后的植入前发育

图4-3 失败的卵浆内原核注射和实际的卵浆外原核注射

表4-1 人多原核胚胎选择性原核减灭术（SPnR）后的植入前发育

表4-2 人原核期胚胎原核移植（SPnR／ICPI方式）及其后的植入前发育

4.3 讨论

4.3.1 人原核从原核期胚胎移出操作（SPnR）及其重构胚的后续发育潜能

4.3.2 多原核胚胎选择性原核减灭术（SPnR）及其临床应用／开发价值

4.3.3 人原核期胚胎SPnR／ICPI方式原核移植操作及其重构胚的后续发育潜能

4.4 小结

5 研究结论

6 参考文献

7 文献综述：人自体胚胎干细胞创建技术的研究进展

7.1 自体ESCs自体遗传背景构建的主流技术

7.2 自体ESCs创建的“低效率”问题

7.3 自体ntESCs创建特征和低效率原因分析

7.4 自体生殖细胞单性生殖方式ESCs创建特征和低效率原因分析

7.5 人自体ESCs的创建前景和应用展望

7.6 参考文献

8 附件：论文、专利、科研项目汇编

8.1 人AutoMFF和AutoCCs辅助的体外成熟共培养促进ccdIMOs体外成熟（英文）

8.2 INSR基因17外显子一个奇特的SNP与华裔PCOS患者胰岛素低敏相关（英文）

8.3 GnRHa，而非GnRHant，可以有效地逆转卵巢刺激导致的小鼠子宫内膜integrin-β3和LIF低表达，改善子宫对胚胎的容受性（英文）

8.4 文献综述《人自体胚胎干细胞创建技术的研究进展》录用通知复印件

8.5 月经的生理和调节

8.6 医源性多胎妊娠的伦理问题及对策

8.7 国家知识产权局有关《一种人体未成熟卵体外成熟培养方法》实用新型专利申请受理通知书复印件

8.8 国家自然科学基金面上项目有关《亲缘性基因印记校正的雌核发育／雄核发育技术创建人自体胚胎干细胞的研究》立项详情复印件

9 致谢

人类未成熟卵体外成熟培养、雌/雄原核形态学判别和原核期胚胎原核移植及其重构胚后续发育潜能的研究

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