水飞蓟宾对硝普钠所致PC12细胞损伤的保护作用及其机制研究

论文摘要

本文系统地研究了水飞蓟宾（Silibinin）体外抗PC12凋亡的分子机制,着重阐述了在硝普钠（Sodium nitroprusside, SNP）诱导的分化的PC12细胞凋亡过程中,水飞蓟宾起保护作用的分子机理。水飞蓟宾是天然的多酚黄酮类化合物,为菊科植物水飞蓟(（Silybum marianum）的果实经提取精制而得,其主要作用为膜稳定性及抗氧化作用。目前为止常被用于肝脏保护剂,但是除此外水飞蓟宾还具有其他的活性,如抗癌,心脏保护及脑保护作用。鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞系是来源于肾上腺髓质的嗜铬细胞,被广泛应用作交感神经节样神经元的模型。一氧化氮（NO）可导致神经细胞的凋亡,并参与到了一系列的神经病理学过程中,包括脑缺血,神经退行性疾病等。硝普钠可作为体外NO的供体,在许多实验中被用作诱导神经元损伤的模型药物。结果表明,我们采用全反式维甲酸（All-trans retinoic acid, ATRA, RA）可以明显诱导PC12细胞向神经元细胞分化,硝普钠对于分化后的PC12细胞具有明显的抑制作用,并诱导了PC12细胞的坏死和凋亡,且此抑制作用以凋亡为主。形态学观察,流式细胞术和Western Blot分析均显示硝普钠可引起PC12细胞DNA损伤,诱导了细胞凋亡。在硝普钠诱导PC12细胞凋亡的过程中,caspase-8,-9和-3的含量呈时间依赖性的增加,上调了Bax蛋白在线粒体的分布,降低了线粒体膜电位,并同时促进了细胞色素c由线粒体释放到胞浆中,说明此凋亡的发生是同时激活了死亡受体通路和线粒体通路。而加入水飞蓟宾后,可明显抑制硝普钠诱导的caspase-8,-9,和-3的活化,提高了线粒体膜电位,抑制了凋亡,同时发现细胞出现了自噬的高水平。形态学观察、流式细胞术和Western Blot分析表明,此凋亡保护作用主要是通过活化Ras蛋白来实现的,Ras活化后,激活了下游的PI3K／NF-kB途径和Raf-1／MEK／ERK途径,这两条通路均起到了保护细胞的作用,但其机理有所差异,PI3K／NF-kB途径可以促进自噬从而抑制凋亡的发生,但是Raf-1／MEK／ERK途径则是起到了直接的抑制凋亡的作用。综上所述,水飞蓟宾能有效地抑制硝普钠诱导的PC12细胞的凋亡,从而可能使水飞蓟宾在治疗神经相关的疾病上发挥作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 细胞凋亡分子机制研究进展
• 1.1 细胞凋亡的概念
• 1.2 细胞凋亡的特征
• 1.3 细胞凋亡的一些调控因素
• 1.4 细胞凋亡的经典途径
• 2. 细胞自噬及其分子机制研究进展
• 2.1 细胞自噬的概念及功能
• 2.2 自噬的分类与自噬体形成的分子基础
• 2.3 细胞自噬的一些调控因素
• 2.4 自噬与凋亡的关系
• 3. 水飞蓟的化学成分及药理学研究进展
• 3.1 水飞蓟宾的简介
• 3.2 水飞蓟宾活性的研究进展
• 参考文献
• 第二章、水飞蓟宾抑制硝普钠诱导的PC12细胞凋亡
• 1. 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 实验结果
• 2.1 维甲酸诱导PC12细胞的分化
• 2.2 硝普钠对PC12细胞有时间剂量依赖性的抑制作用
• 2.3 LDH检测硝普钠时间依赖性诱导PC12细胞发生凋亡
• 2.4 流式细胞术检测硝普钠时间依赖性诱导PC12细胞发生凋亡
• 2.5 Western Blot法检测SNP诱导细胞中凋亡相关蛋白的表达
• 2.6 水飞蓟宾对PC12细胞无明显的生长抑制作用
• 2.7 水飞蓟宾逆转硝普钠对PC12细胞的抑制作用
• 2.8 形态学观察水飞蓟宾对PC12细胞的保护作用
• 2.9 吖啶橙荧光染色观察水飞蓟宾对PC12细胞的保护作用
• 2.10 罗丹明荧光染色观察水飞蓟宾对PC12细胞的保护作用
• 2.11 流式细胞术检测水飞蓟宾对细胞的保护作用
• 2.12 Western Blot法检测水飞蓟宾对细胞的保护作用
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第三章 自噬在水飞蓟宾保护SNP诱导PC12细胞凋亡中的作用及机制
• 1. 实验部分
• 1.1 实验材料
• 1.2 试验方法
• 2. 试验结果
• 2.1 水飞蓟宾促进了自噬相关蛋白的表达
• 2.2 MDC荧光染色观察水飞蓟宾对自噬的影响
• 2.3 水飞蓟宾对MAPK家族及PI3K/NF-kB通路蛋白的影响
• 2.4 流式细胞术检测Ras/Raf/MEK/ERK及PI3K/NF-kB在自噬上的作用
• 2.5 Western Blot法检测Ras/Raf/MEK/ERK在自噬中的作用
• 2.6 Western Blot法检测Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/NF-kB通路间的关系
• 2.7 Ras及其下游蛋白在促进自噬方面的作用
• 2.8 Ras及其下游蛋白在抑制凋亡方面的作用
• 2.9 Western Blot法检测各抑制剂对自噬及凋亡相关蛋白的影响
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 致谢