羊传染性脓疱病毒分离株B2L基因的克隆与序列分析及PCR诊断方法的研究

论文摘要

本试验对CEV内蒙古分离株OV/nm-05株进行传代培养,待出现典型的CPE后收毒并进行DNA的提取,根据已发表的CEV B2L基因序列,设计引物,进行B2L基因的特异性扩增,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序。结果表明:OV/nm-05株的B2L基因长为1133bp。核苷酸序列比较、分析结果表明:OV/nm-05株与Strain NZ2同源性最高,达97.9%,与N86.20a最低,为84.2%,说明OV/nm-05株B2L基因与参考毒株之间差异不大。本试验根据已发表的CEV NZ2株的序列,设计引物,对OV/nm-05株、CPV和新生犊牛睾丸原代细胞的核酸进行PCR扩增,结果表明:只有OV/nm-05株扩增出约440bp左右的特异性片段,其它均为阴性,说明该PCR扩增体系具有良好的特异性。对OV/nm-05株进行敏感性试验,结果表明:该PCR扩增体系可检测出1.1ng模板,说明该PCR扩增体系具有较高的敏感性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 羊传染性脓疱的概述
• 1.2 我国对CE 的研究概况
• 1.3 CEV 病原学特征及其研究进展
• 1.3.1 病毒的形态结构
• 1.3.2 CEV 的理化性质
• 1.3.3 CEV 的基因组结构
• 1.3.4 病原性
• 1.3.5 CEV 生物学特性
• 1.4 流行病学
• 1.4.1 CE 的传染源及流行特征
• 1.4.2 传播途径
• 1.4.3 易感动物
• 1.5 致病机理
• 1.6 临床症状及病理变化
• 1.6.1 临床症状
• 1.6.2 病理变化
• 1.7 诊断方法
• 1.7.1 电子显微镜检查
• 1.7.2 分离培养
• 1.7.3 动物试验
• 1.7.4 血清学诊断
• 1.7.5 鉴别诊断
• 1.7.6 PCR 诊断
• 1.8 免疫学特性及免疫方法研究
• 1.8.1 CEV 的细胞免疫特性
• 1.8.2 CEV 的局部免疫特性
• 1.8.3 CEV 感染或免疫后抗体检测
• 1.8.4 免疫方法
• 1.9 CE 的防制
• 1.10 本研究目的和意义
• 2 试验一 CEV 内蒙古分离株OV/NM-05 株B2L 基因的克隆和序列分析
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验毒株
• 2.1.2 载体、菌株和主要试剂
• 2.1.3 培养基和抗生素
• 2.1.4 试验用犊牛睾丸细胞
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 引物的设计与合成
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 总DNA 的提取
• 2.2.3 B2L 基因克隆与序列分析
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 目的基因的PCR 扩增
• 2.3.2 重组质粒鉴定结果
• 2.3.3 重组质粒测序结果
• 2.3.4 OV/NM-05 株B2L 基因序列比较分析
• 2.4 讨论
• 3 试验二 CEV PCR 诊断方法的研究
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试验毒株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 引物的设计与合成
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 病毒的增殖
• 3.2.2 模板DNA 的制备
• 3.2.3 DNA 含量的测定
• 3.2.4 PCR 扩增
• 3.2.5 特异性试验
• 3.2.6 敏感性试验
• 3.2.7 PCR 产物的电泳检测
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 PCR 扩增结果
• 3.3.2 特异性试验结果
• 3.3.3 敏感性试验结果
• 3.4 讨论
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介