金沙江干热河谷区胡枝子根瘤菌多样性与系统发育研究

论文摘要

本研究利用数值分类、BOXAIR-PCR指纹图谱、16S rDNA PCR-RFLP、16S rDNA和GSⅡ序列分析等方法,研究了分离自金沙江干热河谷区的86株胡枝子根瘤菌的多样性和系统发育,结果表明金沙江干热河谷区胡枝子根瘤菌蕴涵丰富的生物多样性。通过数值分类,金沙江干热河谷区的胡枝子根瘤菌在85.6%的相似性水平上分为6个群,其中大部分菌株（68.6%）属于Bradyrhizobium,供试未知菌株表现出极大的表型性状多样性。大多数供试未知菌株能耐高温（60℃）和低pH（4.0）,在低温（10℃）或者高pH（9.0）条件下生长很差,耐盐性也很差。供试未知菌株的16S rDNA用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和TaqⅠ酶切后具有15种遗传图谱类型,其中9种供试未知菌的16S rDNA遗传图谱类型不同于所选用的已知参比菌株。BOXAIR-PCR的分群结果分散,在82%的相似性水平上,所有供试未知菌株分为37个群,很多在16S rDNA PCR-RFLP分析具有相同的遗传类型以及数值分类中聚于同一表观群的菌株也有了较大差异,表明了供试菌株在基因组上差异很大。16S rDNA序列与GSⅡ序列分析结果表明:16S rDNA序列与GSⅡ序列分别构建的系统发育树在属水平上基本一致,6株代表菌株分布于Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Bradyrhizobium四个属,但16S rDNA序列的同源性比GSⅡ高,6株代表菌株间16S rDNA序列的同源性在87.5%～99.5%之间,GSⅡ序列的同源性在79.4%～89.8%之间;而代表菌株与亲缘关系最近的参比菌株间的16S rDNA序列的同源性为99.9%～100%,GSⅡ的同源性为88.9%～99.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 根瘤菌多样性研究进展
• 1.2.1 表型多样性研究
• 1.2.2 遗传多样性
• 1.3 根瘤菌的系统发育研究
• 1.3.1 细菌系统发育学的发展
• 1.3.2 依据"分子钟"基因序列建立的根瘤菌系统发育关系
• 1.4 根瘤菌的最新分类系统
• 1.4.1 Rhizobium
• 1.4.2 Sinorhizobium
• 1.4.3 Mesorhizobium
• 1.4.4 Azorhizobium
• 1.4.5 Allorhizobium
• 1.4.6 Bradyrhizobium
• 2.本研究的立论依据与目的
• 3.实验材料与方法（所用培养基及试剂配方见附录2）
• 3.1 采样、分离纯化、回接
• 3.1.1 采样
• 3.1.2 菌株分离
• 3.1.3 回接实验
• 3.2 供试菌株
• 3.3 数值分类
• 3.3.1 唯一碳源利用（编码1-33）
• 3.3.2 亚甲蓝还原反应（编码34）
• 3.3.3 石蕊牛奶反应（编码35-39）
• 3.3.4 3-酮基乳糖测定（编码40）
• 3.3.5 唯一氮源的利用（编码41-53）
• 3.3.6 过氧化氢酶试验（编码54）
• 3.3.7 脲酶测定（编码55）
• 3.3.8 对染料及化学药物的抗性测定（编码56-73）
• 3.3.9 对抗生素的抗性测定（编码74-97）
• 3.3.10 耐尔蓝还原反应（编码98）
• 3.3.11 L-苯丙氨酸脱氨酶测定（编码99）
• 3.3.12 肉汤生长试验（编码100）
• 3.3.13 BTB产酸产碱反应（编码101）
• 3.3.14 耐酸碱测定（编码104-106）
• 3.3.15 生长温度范围测定（编码107-111）
• 3.3.16 耐盐性测定（编码112-117）
• 3.4 DNA提取
• 3.5 BOXAIR-PCR指纹分析
• 3.6 16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析
• 3.7 16S rDNA序列分析
• 3.8 GS Ⅱ序列分析
• 4.实验结果处理
• 4.1 数值分类
• 4.1.1 性状编码
• 4.1.2 相似性计算
• 4.1.3 聚类方法
• 4.2 BOXAIR-PCR和16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱分析
• 4.3 16S rDNA与GSⅡ序列结果分析
• 5.结果与讨论
• 5.1 数值分类（数值分类数据见附录1）
• 5.2 遗传多样性（电泳图谱见附录3）
• 5.2.1 BOXAIR-PCR指纹图谱分析
• 5.2.2 16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱分析
• 5.3 序列分析（序列见附录4）
• 5.3.1 16S rDNA序列分析
• 5.3.2 GSⅡ序列分析
• 6 结论
• 7 对于进一步研究的建议
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 数值分类数据
• 附录2 实验中所用培养基及试剂配方
• 培养基配方
• 主要试剂配方
• 附录3.供试菌株的BOX和16S rDNA酶切图谱
• 供试菌株的BOXAIR-PCR指纹图谱
• 供试菌株的16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱
• 附录4.16S rDNA和GSⅡ基因序列
• 16S rDNA序列
• GSⅡ基因序列