论文题目: 马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PIN Ⅱ-2x的克隆及其转化水稻的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 卜庆云
导师: 杨世湖
关键词: 水稻,二倍体马铃薯,马铃薯蛋白酶抑制剂基因,水稻启动子,玉米启动子,转基因水稻,西红柿原系统素
文献来源: 南京农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 植物来源的蛋白酶抑制剂种类众多，功能广泛。它可作为植物的储藏蛋白；也可与植物体内的蛋白质相互作用来调节蛋白质的代谢；更为重要的是，它可以作为植物抵抗昆虫和病原菌侵害的重要手段。马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ属于丝氨酸蛋白酶抑制剂亚族，具有抗虫谱广、抗病、抗炎、抗癌等功能，而且对人、畜等安全。此外马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ还具有组织特异型表达和诱导型表达等特征，能受多种外界环境诱导表达，是研究伤害信号传导的模式报告基因。所以研究和利用马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因具有重要的理论意义和实际应用价值。本文是从二倍体马铃薯中克隆了新的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因并转化水稻。主要结果如下： 1、根据GenBank发表的四倍体马铃薯栽培种(Solanum.tuberosum)来源的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因序列，用PCR方法从二倍体马铃薯IVP101(Solanum.phurejia)扩增得到马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的cDNA和DNA，命名为PINⅡ-2x。测序表明，PINⅡ-2x基因组DNA长度580bp，含有一个115bp的内含子，cDNA有462bp(除去终止密码子)。推测的PINⅡ-2x蛋白质分子量是16.6KD，等电点6.08。与其他马铃薯蛋白抑制剂Ⅱ同源性比较表明，核苷酸同源性高达88％；推测的氨基酸序列同源性为93％，并具有完整的信号肽区和两个活性中心。RT-PCR和Northern blot表明，PINⅡ-2x基因的mRNA在叶片中具有伤害诱导表达特性。说明本文克隆的二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PINⅡ-2x属于马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ家族。 2、为提高PINⅡ-2x基因在转基因水稻中的表达水平，本实验特选择单子叶植物中组成型表达的强启动子，水稻肌动蛋白启动子ActⅠ和玉米泛素蛋白启动子UbiⅠ与PINⅡ-2x构建融合载体。依据设计的载体构建策略，分别构建了水稻肌动蛋白启动子ActⅠ和玉米泛素蛋白启动子UbiⅠ驱动的PINⅡ-2x双元载体，pNAR301(ActⅠ5’+PINⅡ-2x+PINⅡ3’)，pNAR302(UbiⅠ5’+PINⅡ-2x+NOS3’)。同时构建了四倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因(PINⅡ)自身诱导型表达的启动子驱动的PINⅡ的双元载体，pNAR303(PINⅡ5’+PINⅡ+PINⅡ3’)。经过酶切验证后，转化入农杆菌菌株EHA105中。 3、利用农杆菌介导的方法，将含有二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PINⅡ-2x的两个双元载体pNAR301(ActⅠ5’+PINⅡ-2x+PINⅡ3’)，pNAR302(UbiⅡ5’+PINⅡ-2x+NOS3’)，以及含有四倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PINⅡ及其
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的研究进展
1.马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的结构、表达特性
2.马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的防御功能
3.马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的表达调控
4.马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的克隆和转基因研究
参考文献
第二章 水稻抗虫转基因研究进展
1.Bt杀虫晶体蛋白基因
2.蛋白酶抑制剂基因
2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因
2.1.1 Bowman-Birk家族
2.1.2 Kunitz家族
2.1.3 PINⅠ和PINⅡ家族
2.2 半胱氨酸蛋白酶抑制剂
2.3 其他蛋白酶抑制剂
3.外源凝集素基因
4.核糖体失活蛋白基因(RIPs)
5.双价或多价抗虫基因
6.转基因抗虫水稻的问题及发展策略
参考文献
第三章 西红柿原系统素的研究进展
1.原系统素的分离、功能域分析
2.原系统素的定位和运输
3.原系统素基因(prosystemin)的克隆
4.原系统素信号的传导
5.原系统素的其他功能
参考文献
第四章 二倍体马铃薯(Solanum.phurejia)蛋白酶抑制剂Ⅱ基因(PINⅡ-2x)的克隆、序列分析
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 二倍体马铃薯
1.1.2 细菌菌株
1.1.3 质粒载体
1.1.4 培养基
1.1.5 各种酶类
1.1.6 试剂盒
1.1.7 其他试剂
1.2 实验方法
1.2.1 马铃薯伤害处理
1.2.2 植物RNA的提取
1.2.3 cDNA文库的构建
1.2.4 PCR扩增
1.2.5 PCR扩增产物的克隆和序列分析
1.2.6 RT-PCR分析
1.2.7 RNA电泳及转膜
1.2.8 探针标记、杂交及检测
2 结果分析
2.1 cDNA文库的质量分析
2.2 全长PINⅡ-2x cDNA和DNA的克隆、序列分析
2.3 二倍体马铃薯PINⅡ-2x氨基酸序列分析
2.4 PINⅡ-2x基因在IVP101叶片中的表达特性
3 讨论
参考文献
第五章 马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的植物表达载体构建
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 酶类
1.1.2 质粒载体
1.1.3 菌株
1.1.4 抗生素
1.1.5 试剂盒
1.1.6 试剂
1.2 方法
1.2.1 大肠肝菌感受态细胞的制备
1.2.2 质粒提取
1.2.3 酶切产物的回收
1.2.4 连接反应与转化
1.2.5 根癌农杆菌EHA105感受态的制备和转化
2.结果与分析
2.1 水稻ActⅠ启动子和PINⅡ-2x融合载体的构建
2.2 玉米Ubi启动子和PINⅡ-2x融合载体的构建
2.3 马铃薯PINⅡ启动子和PINⅡ融合载体的构建
2.4 双元载体转化农杆菌EHA105
参考文献
第六章 农杆菌介导转化获得转PINⅡ-2x基因水稻植株
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 水稻品种
1.1.2 菌株
1.1.3 质粒
1.1.4 组培试剂
1.1.5 其他试剂
1.2 实验方法
1.2.1 农杆菌的活化
1.2.2 水稻愈伤的转化、抗性愈伤的筛选和植株再生
1.2.3 水稻基因组DNA的提取
1.2.4 转基因水稻的PCR检测
1.2.5 转基因水稻叶片的潮霉素抗性鉴定
1.2.6 转基因水稻T0代种子的潮霉素发芽实验
1.2.7 转基因水稻的Southern blot鉴定
1.2.8 转基因水稻的Northern blot鉴定
1.2.9 转基因水稻的抗虫性鉴定
2 结果与分析
2.1 转基因水稻植株的获得
2.2 转基因水稻的PCR鉴定
2.3 转基因水稻叶片的潮霉素筛选
2.4 转基因T0代水稻种子的潮霉素发芽
2.5 转基因水稻的Southern blot
2.6 转基因水稻的Northern blot
2.7 转基因水稻的二化螟鉴定
3 讨论
参考文献
第七章 西红柿原系统素基因(prosystemin)转化水稻的初步研究
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 水稻品种、菌株、质粒和试剂
1.1.2 PCR引物
1.2 实验方法
1.2.1 载体的构建
1.2.2 转基因水稻的获得
1.2.3 转基因水稻的PCR检测
1.2.4 转基因水稻叶片和种子的潮霉素抗性鉴定
1.2.5 转基因水稻的Southern blot鉴定
1.2.6 转基因水稻的Northern blot鉴定
1.2.7 转基因水稻的抗虫性鉴定
2 结果与分析
2.1 植物表达载体的构建
2.1.1 玉米Ubi启动子和西红柿原系统素基因的融合载体的构建
2.1.2 西红柿原系统素基因和马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因双价载体的构建
2.2 转基因水稻的获得和初步鉴定
2.3 转基因水稻的Southern blot
2.4 转基因水稻的Northern blot
2.5 转基因水稻的二化螟鉴定
3 讨论
参考文献
全文结论
附录
攻读博士期间发表文章
致谢
发布时间: 2006-10-20
参考文献
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