效应物对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

论文摘要

以中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）内脏为材料，通过0.01mol·L-1 Tris-HCI缓冲液(pH 7.5含0.2mol·L-1 NaCl，5％乙醇)抽提处理，硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose（DEAE-32）离子交换柱、Sephadex G-100分子筛、第二次DEAE-32离子交换柱3次层析纯化，获得比活力为4490.79U／mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase，EC3.2.1.52）。该酶亚基分子量分别为121.21、98.63和73.48 kD，等电点为4.5。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-NAG）为底物，测得该酶在0.2mol·L-1磷酸缓冲液（pH5.6）中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.5，最适温度为45℃；该酶在低于45℃，pH 4.9-9.3范围内稳定。在pH5.6的条件下，酶水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.357mmol·L-1，最大反应速度Vmax为10.409umol·L-1·min-1，反应的活化能为76.50KJ／mol。研究几种有机溶剂对该酶活力的影响。结果表明：甲醇和乙醇对酶有先扬后抑作用，正丙醇、异丙醇、甲醛、丙酮、苯酚和二甲亚砜对酶的活性均有不同程度的抑制作用。甲醇、乙醇和异丙醇对酶的抑制类型都为可逆竞争性抑制类型，它们对酶的抑制常数KI分别为3.66mol·L-1、0.36mol·L-1和0.48mmol·L-1。甲醛、苯酚和二甲亚砜对酶的抑制类型属于可逆非竞争性抑制类型，它们对酶的抑制常数KI分别为0.288mol·L-1、0.268mmol·L-1和0.276 mol·L-1。正丙醇、丙酮对酶的抑制类型为可逆混合型抑制类型，正丙醇对酶的抑制常数KI与KIS分别为3.14mmol·L-1和9.35mmol·L-1，丙酮对酶的抑制常数KI与KIS分别为0.195mol·L-1和0.620 mol·L-1。戊二醛对酶活力没有影响。研究金属离子对该酶的影响，结果表明：Na+对酶有激活作用，Ba2+、Ag+对酶活力有先扬后抑作用。Li+和K+对酶有微弱的抑制作用，Mg2+、Cu2+、pb2+、Zn2+、Mn2+和Al3+对酶活力有不同程度的抑制作用。Mg2+、Cu2+和Zn2+对酶的抑制均表现为可逆非竞争性抑制类型，它们对酶的抑制常数KI分别为0.704mol·L-1、1.25mmol·L-1和8.10mmol·L-1。Ag+对酶的抑制作用为可逆反竞争性抑制类型，Ag+对结合酶（ES）的抑制常数KI为204.508mmol·L-1。pb2+对酶的抑制表现为可逆混合型抑制，pb2+对酶的抑制常数KI与KIS分别为10.44mmol·L-1和2.217mol·L-1。Ca2+对酶活力没有显著影响。研究12种氨基酸对该酶的影响。结果表明：在特定浓度范围内，L-Gly、L-Val、L-Thr、L-Ala、L-Phe和L-Ser等氨基酸对酶活力没有显著影响，而L-Gln、L-Met、L-Pro、L-Arg、L-His和L-Lys对河蟹NAGase有不同程度的抑制作用。L-Pro对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型，L-Pro对酶的抑制常数KI为702.87mmol·L-1。L-Arg、L-His和L-Lys对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型，它们对酶的抑制分别为1.682mmol·L-1、85.81mmol·L-1和1.517mmol·L-1。水体中的富营养化产生的SO32-对该酶活力有抑制作用，抑制类型为可逆反竞争性类型，5032-对酶的抑制常数KI为253.995mmol·L-1。NO2-在0-10mmol·L-1范围内对酶活力有激活作用。研究过氧化氢对该酶的影响，结果表明，过氧化氢对酶有抑制作用，抑制类型为可逆反竞争性类型，过氧化氢对结合酶（Es）的抑制常数KI为136.78mmol·L-1。研究尿素对酶的影响，结果表明，尿素对酶活力有抑制作用，尿素对酶的抑制属于可逆混合型抑制类型，尿素对酶的抑制常数KI与KIS分别为379.02mmol·L<sub>-1和1.182mol·L-1。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstracts
• 1 引言
• 1.1 中华绒螯蟹简介
• 1.2 河蟹养殖现状与存在的问题
• 1.2.1 目前河蟹养殖现状
• 1.2.2 河蟹养殖存在的问题
• 1.3 河蟹的研究概况
• 1.4 几丁质
• 1.5 几丁质酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究概况
• 1.5.1 几丁质酶系
• 1.5.2 几丁质酶研究概况
• 1.5.3 几丁质酶的应用
• 1.5.4 NAGase的研究概况
• 1.6 本课题的研究内容与研究意义
• 2 实验材料、仪器与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 仪器设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 蛋白质浓度的测定
• 2.3.2 酶活力的测定和比活力的计算
• 2.3.3 河蟹NAGase的分离纯化
• 2.3.4 酶的性质测定
• 2.3.5 酶催化反应的动力学性质研究
• 2.3.6 有机溶剂对酶活力的影响
• 2.3.7 金属离子对酶活力的影响
• 2.3.8 氨基酸对酶活力的影响
• 3^2-对酶的影响'>2.3.9 水体SO₃^2-对酶的影响
• 2.3.10 水体亚硝酸盐氮对酶的影响
• 2.3.11 过氧化氢对酶活力的影响
• 2.3.12 尿素对酶活力的影响
• 3 实验结果
• 3.1 酶的分离纯化与纯度鉴定
• 3.2 河蟹NAGase的理化性质
• 3.2.1 酶的亚基数及亚基分子量
• 3.2.2 酶的等电点
• 3.3 酶催化pNP-NAG水解反应的动力学性质
• 3.3.1 酶催化pNP-NAG水解的动力学参数
• 3.3.2 酶催化pNP-NAG水解反应的活化能
• 3.3.3 酶催化pNP-NAG水解反应最适温度与酶的热稳定性
• 3.3.4 酶催化pNP-NAG水解反应最适pH值与酶的酸碱稳定性
• 3.4 有机溶剂对河蟹NAGase的影响
• 3.4.1 甲醇对河蟹NAGase的影响
• 3.4.2 乙醇对河蟹NAGase的影响
• 3.4.3 正丙醇对河蟹NAGase的影响
• 3.4.4 异丙醇对河蟹NAGase的影响
• 3.4.5 甲醛对河蟹NAGase的影响
• 3.4.6 戊二醛对河蟹NAGase的浓度效应
• 3.4.7 丙酮对河蟹NAGase的影响
• 3.4.8 苯酚对河蟹NAGase的影响
• 3.4.9 二甲亚砜对河蟹NAGase的影响
• 3.5 金属离子对河蟹NAGase的影响
• +、Na⁺、K⁺、Ba²⁺和Ca²⁺离子对酶活力的影响'>3.5.1 Li⁺、Na⁺、K⁺、Ba²⁺和Ca²⁺离子对酶活力的影响
• 2+对河蟹NAGase活力的影响'>3.5.2 Mn²⁺对河蟹NAGase活力的影响
• 3+对河蟹NAGase活力的影响'>3.5.3 正三价Al³⁺对河蟹NAGase活力的影响
• 2+对河蟹NAGase的影响'>3.5.4 Mg²⁺对河蟹NAGase的影响
• 2+对河蟹NAGase的影响'>3.5.5 Cu²⁺对河蟹NAGase的影响
• 2+对河蟹NAGase的影响'>3.5.6 pb²⁺对河蟹NAGase的影响
• 2+对河蟹NAGase的影响'>3.5.7 Zn²⁺对河蟹NAGase的影响
• +对河蟹NAGase的影响'>3.5.8 Ag⁺对河蟹NAGase的影响
• 3.6 氨基酸对河蟹NAGase的影响
• 3.6.1 L-Pro对河蟹NAGase的影响
• 3.6.2 L-Arg对河蟹NAGase的影响
• 3.6.3 L-His对河蟹NAGase的影响
• 3.6.4 L-Lys对河蟹NAGase的影响
• 3^2-对河蟹NAGase的影响'>3.7 水体SO₃^2-对河蟹NAGase的影响
• 3.8 水体亚硝酸盐氮对河蟹NAGase的影响
• 3.9 过氧化氢对河蟹NAGase的影响
• 3.10 尿素对河蟹NAGase的影响
• 4 讨论
• 4.1 酶的分离纯化与理化性质
• 4.2 有机溶剂对河蟹NAGase的影响
• 4.3 金属离子对河蟹NAGase的影响
• 4.4 氨基酸对河蟹NAGase的影响
• 3^2-、NO₂^-对河蟹NAGase的影响'>4.5 SO₃^2-、NO₂^-对河蟹NAGase的影响
• 4.6 过氧化氢河蟹NAGase的影响
• 4.7 尿素对河蟹NAGase的影响
• 结论
• 参考文献
• 已发表论文
• 待刊论文
• 致谢