蝴蝶兰花发育相关B类MADS-box基因的克隆与鉴定

论文摘要

MADS-box基因编码的转录因子广泛存在于酵母、植物、昆虫、两栖动物以及哺乳动物当中。在植物中,MADS-box基因对植物的发育过程起着十分重要的作用。MADS-box蛋白参与了植物发育过程中很多基因的表达的调控,尤其是花器官确定中的基因表达。但目前的研究多集中在双子叶植物中。兰科植物的花花型较大而且高度进化,具有彩色的萼片,特化的唇瓣和雌雄蕊合生的蕊柱,是研究单子叶植物中的MADS-box基因的理想材料。我们用RT-PCR的方法从蝴蝶兰花瓣的总RNA中扩增出了4个MADS-box基因的全长cDNA,序列与系统发生进化树的分析表明它们分别与拟南芥的PISTILLATA基因和APETALA3基因同源,分别命名为Ph9I9（Phalaenopsis PISTILLATA#9）,PhPI10PhPI15和PhAP3（Phalaenopsis APETALA3）。在PhPI9,PhPI10和PhPI15的C末端具有PI类基因特有的PI基序;PhAP3的C末端同样存在单子叶植物AP3类基因所特有的PI-derived基序和paleo-AP3基序。Southern杂交证明这4个基因均以单拷贝存在于蝴蝶兰基因组中。通过RT-PCR与原位杂交分析,表明PhPI9,PhPI10和PhPI15均在蝴蝶兰的生殖发育阶段表达,在营养生长阶段不表达,PhPI15在所有花器官中都表达,而PhPI9和PhPI10仅仅在唇瓣表达;PhAP3在蝴蝶兰生长的各个时期以及所有的花器官都有表达。随着花发育的进行,3个PI类MADS-box基因在花粉块中高表达,PhAP3则在药帽处高表达。通过将PhPI15的cDNA正向转化烟草以研究PhPI15的功能。异位表达PhPI15的烟草不仅在开花时植株个体明显小于处于花期的野生型植株,而且转基因植株的花型也明显小于野生型植株的花型,并且转基因植株的花还表现出雄性不育的表型。综上所述,我们克隆了4个蝴蝶兰中花发育相关的B类MADS-box基因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 综述
• 一、MADS-box基因家族
• 1.MADS-box基因的概述
• 2.MADS-box的起源、进化
• 3.植物MADS-box基因的分类
• 4.植物MADS-box基因的研究进展
• 5.植物MADS-box基因的生物学功能及其多效性
• 6.B类MADS-box基因的特点
• 7.兰科植物中的MADS-box基因
• 二、花发育模型
• 1.花发育概述
• 2.ABCDE模型的提出
• 三、植物MADS-box基因研究存在的问题与展望
• 1.目前存在的问题
• 2.应用前景
• 四、研究的目的和意义
• 第二章 研究的技术路线
• 1.前言
• 2.材料
• 3.方法
• 3.1 蝴蝶兰花发育相关B族MADS-box基因ORF的克隆
• 3.2 Southern杂交
• 3.3 RT-PCR
• 3.4 原位杂交
• 3.5 PhPI15 ORF的烟草转化
• 3.6 农杆菌介导的烟草的转化
• 3.7 转基因烟草的鉴定
• 3.8 三维模型的建立
• 第三章 结果与讨论
• 1.蝴蝶兰花发育各阶段的确立
• 2.蝴蝶兰B族MADS-box基因ORF的克隆和序列分析
• 3.Southern杂交分析
• 4.蝴蝶兰B族MADS-box基因表达的时空模式
• 4.1 RT-PCR检测表达情况
• 4.2 原位杂交
• 5.烟草转基因
• 6.蝴蝶兰MADS-box基因模型的建立
• 第五章 小节与展望
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢