同源重组技术构建蛋白酶A低表达且能产β-葡聚糖酶的酿酒母菌株及其性能研究

论文摘要

β-葡聚糖在啤酒生产中会造成过滤困难以及成品啤酒的非生物性混浊等问题,一定程度上影响啤酒的质量和保质期。啤酒泡沫,特别是纯生啤酒的泡沫问题会受到蛋白酶A（PrA）很大程度的影响。现代啤酒工业中通过生产过程中添加微生物来源的β-葡聚糖酶制剂以及PrA的抑制剂等手段来降低它们带来的消极影响,但这无疑使啤酒生产变得复杂而且提高了成本。因此,本研究采用同源重组技术以枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因替换酿酒酵母染色体组中的一个PEP4等位基因,构建能够降解β-葡聚糖而PrA低表达的重组酿酒酵母。结果表明,构建的重组菌株能有效的分泌β-葡聚糖酶同时降低了PrA的表达,在删除了进行基因操作时引入的抗性标记基因后,构建完成了适合于啤酒工业特别是纯生啤酒酿造的重组酿酒酵母菌株。同时对重组酿酒酵母菌株的生理和发酵性能进行了研究。主要研究结果如下:从酿酒酵母基因组中PCR扩增PGK1启动子、MFα1信号肽以及ADH1终止子序列,构建了在酿酒酵母的启动子、分泌序列、终止子作用下的枯草芽孢杆菌bg1S基因（编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶）在酿酒酵母中的表达单元。并以KanMX的kanr为筛选标记,以质粒Yeplac181为出发质粒构建了酿酒酵母的表达载体。表达载体中包含的bg1S表达单元转入工业酿酒酵母菌株WZ65得到了表达,并得到了有效分泌。用DNS法对重组酵母菌生长过程中分泌到培养介质中的β-葡聚糖酶活性进行了测定,结果显示在60h出现最大值,然后下降,在接下来的60h内基本保持稳定。在前人研究的基础上对β-葡聚糖酶活性测定方法进行改进,用刚果红法可以更好的对本文构建的重组酿酒酵母菌株分泌的β-葡聚糖酶酶活进行测定。对重组酶的酶学性质进行了研究,并与枯草芽孢杆菌中表达的野生型β-葡聚糖酶的性质进行了对比。研究发现,本试验构建的重组酵母表达的重组β-葡聚糖酶酶学性质发生了改变。40℃热处理20min造成重组酶活很大损失,残留的酶活只有30℃处理的63.4%;70℃的热处理与40℃处理相比酶活性只降低了17.5%,保持了45.9%的最初酶活,重组酶在高温下的稳定性增强。与野生酶相比,重组酶的最适pH值为5.0,而野生酶在6.0-7.0之间;相比野生酶在pH6.0-7.0有较高的稳定性,重组酶在pH5.0-6.0之间有最大的稳定性。由于酿酒酵母中表达载体不稳定,为了使β-葡聚糖酶在重组酵母菌株更稳定的表达而且降低蛋白酶A对啤酒泡沫阳性蛋白的降解作用,在前期试验证明了构建的bg1S表达单元正确的基础上,用bg1S基因表达单元替换了出发酵母菌株WZ65染色体上的一个PEP4等位基因,构建了PEP4等位基因杂合的重组酿酒酵母菌株SC-βG1、SC-βG2,其基因型为:PEP4/pep4∷KanMX-bg1S。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因在进行替换后得到了有效的表达和分泌,菌株SC-βG1、SC-βG2培养过程中最高酶活性出现在培养56-64h时,分别为28.1U和20.2U,与用表达载体表达时的出现最高酶活性的时间基本一致。重组菌对数期的生长速度与出发菌株相比略慢,但稳定期的细胞浓度基本一致。而且稳定期以后的生长变化趋势基本一致。考虑到菌株应用的安全性,利用Cre/loxP系统成功的删除了在构建产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酵母菌株SC-βG1时整合在染色体上的KanMX,而且利用实验中使用的包含Cre/loxP系统的质粒pSH-Z的不稳定性,通过传代使质粒丢失而筛选到2株无抗性标记的重组酵母菌株SC-βG1A、SC-βG1B,整合到重组菌株基因组中的bg1S基因表达单元没受到影响。对最终获得的无抗性标记的菌株SC-βG1A、SC-βG1B分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活进行了测定,结果显示删除Kanr的菌株保留了原来菌株的β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性,分别为32.3U和29.1U。对最终获得的重组菌株在实验室进行了继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、凝聚性、热死灭温度等几个重要的生理指标进行了测试,并对发酵液进行了蛋白酶A活性,β-葡聚糖酶活性的测定和研究。结果表明重组菌株在麦芽汁发酵过程中能够产生较高活性的β-葡聚糖酶。被替换掉一个等位PEP4基因的酿酒酵母菌株的蛋白酶A的活性与出发菌株WZ65相比降低了30-40%。重组菌SC-βG1A、SC-βG1B中bg1S表达单元在传代过程中遗传稳定,不发生丢失。与对照菌株相比,重组菌初期生长变缓,但稳定期细胞浓度基本相同,稳定期以后的浓度变化一致;热死灭温度降低2℃;转化菌遗传性能稳定,与对照菌生长性能、发酵力、凝聚性均基本相似。我们选用Saccharomyces cerevisiae SC-βG1A进行了小试,对其啤酒酿造过程中的生长发酵性能以及成品的口味风味特性等方面进行了测试;对该菌株酿制啤酒的多项指标包括浓度、浊度、色度、苦味值、pH、α-N、总酸、酒精度、发酵度、外观糖度、双乙酰、泡持性、CO2、口味、风味等也进行了测试。试验结果表明,重组菌酿制的啤酒酯香味突出、苦味较重,其它与现行干啤相近;各种理化指标均达到国家标准优级;啤酒泡沫的泡持性从202s增加到274s。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 大麦中的β-葡聚糖及其在酿酒过程中的降解
• 1.1 大麦β-葡聚糖的结构和性质
• 1.2 可以降解大麦葡聚糖的内源性酶
• 1.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶
• 1.2.2 外切-β-葡聚糖水解酶以及β-葡萄糖苷酶
• 1.3 啤酒酿造过程中大麦葡聚糖的降解
• 1.3.1 制麦过程中β-葡聚糖的降解
• 1.3.2 糖化过程中β-葡聚糖的降解
• 1.3.3 发酵过程中添加外源性葡聚糖酶
• 1.4 β-葡聚糖对酿酒过程中的影响及对策
• 1.4.1 培育低含量β-葡聚糖大麦
• 1.4.2 添加微生物来源的酶制剂
• 1.4.3 构建表达外源β-葡聚糖酶的酿酒酵母菌株
• 2 酿酒酵母中的蛋白酶A以及对啤酒酿造的影响
• 2.1 酿酒酵母的蛋白酶系统
• 2.1.1 液泡蛋白酶（Vacuolar proteases）
• 2.1.2 胞质蛋白酶体（cytosolic proteosome）
• 2.1.3 分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）
• 2.2 酿酒酵母的蛋白酶A
• 2.2.1 蛋白酶A的编码
• 2.2.2 酵母蛋白酶A的结构
• 2.3 蛋白酶A的功能及性质
• 2.4 蛋白酶A的分泌及加工修饰过程
• 2.5 PEP4突变对酵母液泡酶系统的影响
• 2.6 啤酒酿造过程中的蛋白酶A的变化
• 2.7 蛋白酶A对泡沫稳定性的影响
• 2.8 降低啤酒中蛋白酶A的途径
• 2.9 蛋白酶A的测定
• 3 现代分子生物学技术在酿酒酵母（Sacchaaromyces cerevisiae）育种上的应用—啤酒生产方向
• 3.1 对淀粉的充分利用
• 3.2 消除酵母发酵过程中双乙酰的影响
• 3.2.1 双乙酰的代谢
• 3.2.2 低双乙酰工程菌
• 3.3 提高啤酒生产的操作性
• 3.3.1 絮凝性的改善
• 3.3.2 β-葡聚糖酶工程菌构建
• 3.4 改善啤酒泡沫的稳定性
• 3.5 改进啤酒风味
• 3.5.1 增加啤酒的生香物质
• 2S酿酒酵母工程菌的构建'>3.5.2 低H₂S酿酒酵母工程菌的构建
• 3.5.3 低高级醇酿酒酵母
• 3.6 酿酒酵母基因改造前景展望
• 4 选题背景及研究内容
• 第二章 bg1S表达单元的构建以及在酿酒酵母中的表达
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、主要试剂及仪器设备
• 1.1.1 菌株、质粒、试剂
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂及配制
• 1.1.4 主要仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物的合成
• 1.2.2 PCR扩增
• 1.2.3 酶切连接
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.5 枯草芽孢杆菌基因组提取
• 1.2.6 酵母基因组提取
• 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 1.2.8 酵母感受态细胞的制备及转化
• 1.2.9 酿酒酵母转化子的筛选
• 1.2.10 β-葡聚糖酶活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 片断的扩增
• 2.1.1 β-葡聚糖酶基因的扩增
• P的扩增'>2.1.2 PGK1_P的扩增
• S的扩增'>2.1.3 MFα1_S的扩增
• T的扩增'>2.1.4 ADH1_T的扩增
• 2.1.5 KanMX的扩增
• 2.2 表达单元的构建
• P、MFα1_S在质粒pUC18中的克隆'>2.2.1 片断PGK1_P、MFα1_S在质粒pUC18中的克隆
• T在质粒pUC18中的克隆'>2.2.2 片断bg1S、ADH1_T在质粒pUC18中的克隆
• P-MFα1_S-bg1S-ADH1_T的形成'>2.2.3 bg1S基因表达单元PGK1_P-MFα1_S-bg1S-ADH1_T的形成
• 2.2.4 bg1S基因表达单元与KanMX的连接
• 2.2.5 bg1S基因酿酒酵母表达载体的形成
• 2.2.6 重组质粒的PCR、酶切鉴定
• 2.2.7 重组质粒测序
• 2.3 质粒的转化以及转化子的筛选
• 2.4 β-葡聚糖酶的酶活测定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 酿酒酵母中表达的重组β-葡聚糖酶的酶学性质
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂和仪器
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 β-葡聚糖酶的活性测定方法
• 1.2.1.1 刚果红法
• 1.2.1.2 DNS法
• 1.2.2 葡聚糖标准曲线的绘制
• 1.2.3 β-葡聚糖酶酶学性质的测定
• 1.2.3.1 酶的底物专一性比较
• 1.2.3.2 β-葡聚糖酶的最适反应温度
• 1.2.3.3 β-葡聚糖酶的热稳定性
• 1.2.3.4 β-葡聚糖酶最适pH值
• 1.2.3.5 β-葡聚糖酶pH稳定性
• 2 结果与分析
• 2.1 标准曲线的绘制
• 2.2 酶的底物专一性比较
• 2.3 最适反应温度
• 2.4 热稳定性分析
• 2.5 最适pH值
• 2.6 pH稳定性
• 3 讨论
• 3.1 重组酵母菌株分泌的β-葡聚糖酶的酶活测定方法
• 3.2 重组酶酶学性质的改变
• 4 小结
• 第四章 bg1S基因在PEP4位点上的整合表达
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料及主要试剂
• 1.1.1 酵母菌株及质粒
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 工具酶和主要试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 替换用DNA片段的扩增
• 1.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 1.3.3 酵母感受态细胞的制备、转化
• 1.3.4 转化菌的平板筛选
• 1.3.5 基因组DNA提取及重组菌株的PCR鉴定
• 1.3.6 重组菌株的β-葡聚糖酶活测定
• 2 结果与分析
• 2.1 替换片断的扩增
• 2.2 转化以及重组酿酒酵母的筛选
• 2.3 重组酿酒酵母的PCR鉴定
• 2.4 重组酿酒酵母的β-葡聚糖酶酶活性测定
• 2.5 重组酵母菌株的生长性能
• 2.6 重组酿酒酵母SC-βG1生长阶段与产酶曲线的对比
• 3 讨论
• 3.1 基因替换时位点的随机性
• 3.2 重组酿酒酵母菌株的生长速度
• 3.3 保留一个PEP4等位基因的必要性
• 4 小节
• 第五章 重组菌株中标记基因的删除
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂和培养基
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法和步骤
• 1.4.1 pSH-Z质粒的扩增
• 1.4.2 重组酵母感受态的制备及转化
• 1.4.3 转化子的筛选
• 1.4.4 Cre的诱导表达
• r丢失菌株的筛选'>1.4.5 Kan^r丢失菌株的筛选
• r丢失菌株的PCR鉴定'>1.4.6 Kan^r丢失菌株的PCR鉴定
• r丢失菌株的抗性鉴定'>1.4.7 Kan^r丢失菌株的抗性鉴定
• 1.4.8 质粒pSH-Z的传代丢失
• 1.4.9 质粒pSH-Z丢失菌株的PCR鉴定
• 1.4.10 重组菌株中bg1S完整性的PCR验证
• 1.4.11 β-葡聚糖酶酶活的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒pSH-Z的扩增
• r丢失菌的鉴定'>2.2 转化筛选及Kan^r丢失菌的鉴定
• 2.3 质粒pSH-Z的传代丢失及鉴定
• 2.4 β-葡聚糖酶酶活的测定
• 3 讨论
• 4 小节
• 第六章 重组菌株的发酵性能以及其遗传稳定性
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料及主要试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 重组菌及对照菌继代培养
• 1.3.2 重组菌中外源基因的传代稳定性鉴定
• 1.3.3 蛋白酶A活性测定
• 1.3.4 β-葡聚糖酶活性测定
• 1.3.5 生长性能试验
• 1.3.6 发酵力试验
• 1.3.7 酵母凝聚性试验
• 1.3.8 热死灭温度试验
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性丢失的遗传稳定性
• 2.2 重组菌株传代稳定性的PCR检测
• 2.3 蛋白酶A活性检测
• 2.4 β-葡聚糖酶表达的传代稳定性
• 2.5 生长性能
• 2.6 发酵力
• 2.7 凝聚性
• 2.8 热死灭温度
• 3 讨论
• 3.1 蛋白酶A的活性变化
• 3.2 构建蛋白酶A缺失菌株
• 4 小节
• 第七章 重组菌株的酿酒试验
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 酵母菌株及原料
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 啤酒酿造试验方法
• 1.3.2 理化指标及性能分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 各种理化指标测定结果
• 2.2 酵母菌性能测试
• 3 讨论
• 4 小结
• 第八章 主要结论
• 参考文献
• 致谢