一、Th1/Th2细胞在炎症浸润中的不同表现（论文文献综述）
张程斐[1]（2021）在《基于转录组测序研究甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠的机制影响》文中提出目的:通过观察甲炎康泰复方颗粒对自身免疫性甲状腺炎（AIT）大鼠的保护作用,并基于转录组对大鼠甲状腺组织测序,探讨甲炎康泰对甲状腺组织起保护作用的相关靶点及通路,为临床应用提供实验依据。方法:高碘饮水诱导和猪甲状腺球蛋白佐剂注射Lewis大鼠建立AIT模型大鼠40只,造模成功后,按血清TPOAb浓度随机分为模型组、甲炎康泰低（0.708g/kg）、中（1.417g/kg）、高（2.834g/kg）剂量组,每组10只。正常组与模型组大鼠给予1ml/100g的双蒸水,甲炎康泰三剂量组给予中药复方颗粒剂连续灌胃给药8周。药物干预结束后取材,检测大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb及TRAb的浓度;超低温取单侧甲状腺组织放入4%多聚甲醛中固定,用于HE染色与免疫组化检测,另一侧甲状腺组织迅速放入液氮中,待提取RNA,行转录组测序与RT-PCR检测;LC/MS检测甲炎康泰组分;RT-PCR检测甲状腺组织内Jak2、STAT3和HIF-1α mRNA的表达水平;免疫组化检测甲状腺组织中p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α IOD/Area值的变化。细胞实验采用雌性lewis大鼠20只,按体重随机分为:正常组（给予双蒸水）和甲炎康泰组（高剂量颗粒剂2.834g/kg）,每组10只。连续给药7天后麻醉取血获得含药血清。IFN-γ干预Nthy-ori 3-1细胞24h建立自身免疫性甲状腺炎细胞损伤模型,含药血清干预后,CCK-8法检测细胞活性;免疫荧光与Western blot法分别检测p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α的荧光强度以及蛋白表达情况,验证动物实验结果。结果:1.LC/MS检测:甲炎康泰组分结果得到代谢产物10122个,其中负离子数1870个,正离子数8252个。Score评分得到了最高的10个代谢物。2.甲功检测:与正常组相比,模型组T3,T4,FT3,FT4均显着性升高（P<0.01）,TSH降低（P<0.01）。经甲炎康泰干预后,与模型组相比:低剂量组T3,T4,FT3,FT4下降及TSH上升但无明显差异;中剂量组T3（P<0.0 5）,FT3（P<0.01）,FT4（P<0.01）下调明显但TSH上升无统计学差异;高剂量组T3,T4,FT3,FT4下降以及TSH上升均具有显着性差异（P<0.01）。3.抗体检测:与正常组相比,模型组TGAb、TPOAb及TRAb均显着性升高（P<0.01）。经甲炎康泰干预后,与模型组相比:低、中剂量组TGAb、TPOAb均明显降低（P<0.01）;高剂量组TGAb、TPOAb及TRAb均降低,且具有统计学差异（P<0.01）。4.形态学检测:正常组可见大量完整甲状腺滤泡,大小适中,腔内红色胶质充盈均匀,滤泡上皮细胞完整;模型组甲状腺滤泡间质呈弥漫性淋巴细胞浸润,大量滤泡腔被破坏或变小,腔内胶质分布不均或减少,滤泡壁变薄、破坏;3个治疗组甲状腺滤泡间质内淋巴细胞浸润较模型组明显减少,滤泡上皮细胞较为完整,胶质含量略减少,但较模型组轻微,滤泡结构完整。高剂量组略好于低、中剂量组。5.转录组检测:通过测序得出甲炎康泰可对自身免疫性甲状腺炎大鼠产生49个差异表达基因,其中16个下调基因,33个上调基因。GO富集分析中得到两个免疫相关差异表达基因:Dnase113和JAK3,甲炎康泰可能通过上调Dnase113和下调JAK3在甲状腺组织中的表达,以缓解了甲状腺组织内的炎症反应以及相关免疫反应。KEGG富集分析中,缺氧诱导因子HIF-1信号通路在甲炎康泰组下调趋势中富集得分最高且具有明显差异。除此之外,Jak-STAT信号通路,表皮生长因子受体信号通路,原发性免疫缺陷以及坏死性凋亡都与自身免疫性甲状腺炎具有一定的相关性。6.PT-PCR检测:与正常组比较,模型组Jak2、STAT3和HIF-1αmRNA相对表达量皆显着性上调（P<0.01）;与模型组比较,甲炎康泰高剂量组Jak2（P<0.05）、STAT3（P<0.01）和 HIF-1α（P<0.05）均下调。7.免疫组化检测:比较各组平均光密度值IOD/Area,与正常组比较,模型组大鼠甲状腺组织内有较多p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α蛋白表达（P<0.01）。与模型组比较,p-Jak2、p-STAT3和HIF-1α蛋白于甲炎康泰高剂量组表达降低（P<0.05）。8.甲状腺细胞免疫荧光和Western blot检测结果:甲炎康泰组甲状腺细胞活性较模型组显着升高;免疫荧光和Western blot显示,与正常组比较,模型组p-Jak2/Jak2,p-STAT3/STAT3以及HIF-1 α/β-actin表达值均显着性上调（P<0.01）以及其对应的荧光强度也有增加（P<0.01）;与模型组比较,甲炎康泰组p-Jak2/Jak2,p-STAT3/STAT3以及HIF-1α/β-actin表达值均有下调（P<0.05或P<0.01）以及其对应的荧光强度也有下降（P<0.05 或P<0.01）。结论:1.甲炎康泰可一定程度上纠正甲状腺功能和缓解甲状腺结构损伤,可能与其降低循环TGAb、TPOAb及TRAb浓度有关。2.甲炎康泰可能通过上调Dnase113和下调JAK3 mRNA在甲状腺组织中的表达,以缓解了甲状腺组织内的炎症反应以及相关免疫反应;同时,甲炎康泰可能下调HIF-1α信号通路、Jak-STAT信号通路、原发性免疫缺陷信号通路以及坏死性凋亡信号等通路在甲状腺中的表达,以缓解AIT的发展。3.甲炎康泰可能抑制了甲状腺组织中Jak2/STAT3/HIF-1α通路进而缓解了 AIT的发展。4.甲炎康泰对甲状腺细胞具有一定保护作用,可能通过下调p-Jak2/Jak2,p-STAT3/STAT3以及HIF-1α/β-actin的表达及其对应的荧光强度有关,提示甲炎康泰对Jak2/STAT3/HIF-1 α通路有确切的抑制作用。
渠铮[2]（2021）在《旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶NBL-SP对炎症性肠病的干预作用及其机制探究》文中认为旋毛虫是一种多细胞寄生虫,引发宿主的高度免疫抑制是蠕虫侵袭与寄生的重要手段和共有特征,而旋毛虫尤以为甚。大量流行病学调查结果发现:寄生性蠕虫感染率低的发达国家炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）发病率较高。在此基础上有关学者提出、研究并应用“蠕虫疗法”来治疗IBD。“蠕虫疗法”的免疫学基础建立于蠕虫在寄生生活中对肠道免疫系统的影响,主要消除因Th1型免疫反应偏离所引发的免疫病理损伤,同时对Th2型的偏离也有调节作用。大量的动物实验已经证明旋毛虫及其产物,例如排泄分泌产物（Excretion/Secretion production,ESP）,胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）,重组蛋白如丝氨酸蛋白酶抑制剂,丝氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶抑制剂,53k Da蛋白等表现出干预IBD疾病进程的潜力,但具体机制有待进一步阐明。本课题选取已鉴定好的旋毛虫有效抗原成分——新生幼虫期抗原基因丝氨酸蛋白酶基因,利用本实验室前期构建好的表达载体,进行原核表达、纯化与蛋白内毒素的去除。使用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠实验性结肠炎模型,探究旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶（Recombination serine protease from newborn larval of Trichinella spiralis,NBL-SP）对IBD的干预作用并对其潜在机制进行初步探究。本课题采用100μg/只的免疫剂量,免疫次数为3次,免疫间隔为7天的免疫程序对Balb/c小鼠进行腹腔注射免疫。而后采用5%TNBS与无水乙醇体积比1:1共100μL的体系对Balb/c小鼠进行直肠灌注,建立肠炎模型,对照组采用100μL体系50%的乙醇溶液进行直肠灌注。实验分为:对照组,NBL-SP,TNBS,NBLSP+TNBS共四个实验组。与TNBS诱导的肠炎小鼠实验组相比,NBL-SP+TNBS组小鼠的疾病活动指数（Disease activity index,DAI）评分下降,结肠长度缩短现象得到缓解,结肠宏观与微观病变评分降低,髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）活性减弱,上述指标均表明NBL-SP对TNBS诱导的小鼠炎症性肠病具有干预作用。对小鼠血清,结肠肠段培养上清细胞因子分别进行MSD以及Elisa法检测,同时对小鼠脾脏研磨培养后,流式细胞术检测T细胞亚型分化情况。结果表明TNBS诱导的小鼠IBD主要以Th1型免疫应答为主,NBL-SP免疫组主要以Th2与Treg型免疫应答为主。NBL-SP+TNBS组血清,结肠肠段培养上清细胞因子水平及脾脏T细胞亚型分化的结果表明,NBL-SP能够干预TNBS诱导的Th1型免疫应答,降低Th1型免疫应答。作为联系固有性和适应性免疫应答的桥梁,树突状细胞（Dendritic cells,DCs）在启动幼稚T细胞（Na（?）ve T cells）应答中更为擅长,DCs能够控制T细胞应答的方向,使得幼稚的淋巴细胞分化成为不同类型的效应细胞。为进一步探究NBLSP对TNBS诱导的IBD的干预机制,本课题选取DCs作为研究对象,探究NBLSP对DCs表型与功能的影响。细菌内毒素（Lipopolysaccharide,LPS）是公认的能够诱导DCs成熟的药物。流式细胞术与Elisa结果表明NBL-SP能够降低由LPS引起的DCs表面的共刺激分子表达水平的升高,同时提高DCs培养上清Th2与Treg型细胞因子水平,降低LPS引起的Th1型细胞因子的升高。DCs与小鼠脾脏细胞的共孵育实验结果和流式细胞术与Elisa结果一致,NBL-SP刺激后的DCs能够诱导T细胞向Th2与Treg方向分化。以上结果表明,NBL-SP在TNBS诱导的IBD中具有干预作用。NBL-SP能够干扰TNBS诱导的IBD小鼠模型中的T细胞分化方向,DCs可能在其中发挥重要作用。
叶壮[3]（2021）在《调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究》文中研究表明背景:调节性B细胞（Regulatory B cells,Bregs）是以负性调节功能为特征的B细胞亚群,具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用,参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式,亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。目的:（1）明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点,比较SLE患者中Bregs的功能变化,分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。（2）明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。（3）探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响,探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。方法:（1）选取新发初治的SLE患者（n=72）,同时选取年龄、性别匹配的健康对照,统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。（2）通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析,利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平,CBA技术测定Th细胞功能分子水平。（3）分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。（4）随访规范治疗的SLE患者,研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。（5）通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境,建立transwell共培养体系,研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。结果:（1）流式细胞术分析发现,SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低,TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3-CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现,SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关,IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。（2）SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低,IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。（3）体外细胞培养试验表明,SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hi Bregs。（4）SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高,血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高,IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关,BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。（5）SLE患者CD27+CD38-/lo MB、CD27+CD38hi PB和CD27-CD38hi TB的频率增高,CD27-CD38-/lonaive B细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38-/loMB、CD27-CD38-/lonaive B细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27-CD38-/lonaive B细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27-CD38hi TB细胞比例负相关。（6）临床指标相关性分析发现,SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关,IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。（7）与轻中度活动的SLE患者相比,重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。（8）与不伴有肾脏受累的患者相比,伴有狼疮性肾炎SLE患者的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例以及IL-35水平明显降低。（9）经激素及免疫抑制治疗后,IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD38hi Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞频率,IL-10、IL-35水平较基线升高。（10）Transwell共培养CD19+B细胞与CD4+T细胞实验发现,健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平,这种功能的发挥不完全依赖于细胞间的接触,但细胞间的接触可以强化这种抑制作用。健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞功能。IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs对Th细胞及其功能的抑制作用。SLE患者Bregs对健康人Th细胞的抑制作用受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复对Th1、Th17细胞水平及功能的抑制作用。Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。结论:（1）SLE患者外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38hi Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞比例减低,产生IL-35、TGF-β1功能减弱。Bregs分泌功能的发挥主要以CD19+CD24hiCD27+Bregs为主。（2）外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例、IL-35水平的降低可能与SLE患者合并LN有关。（3）SLE患者经有效治疗后,其外周血Bregs和IL-10、IL-35水平可部分恢复。（4）健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平及细胞功能,IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs的抑制作用。（5）SLE患者Bregs抑制功能受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复功能。（6）Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。
韩大飞[4]（2021）在《MicroRNA-10b通过干扰CD4+T细胞亚型平衡促进关节炎的发展》文中研究说明类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种全身系统性的自身免疫性疾病,其主要的病理特征为滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨骼的进行性破坏、新生血管生成以及活化的炎性白细胞（如Th1淋巴细胞和单核细胞）浸润关节滑膜。许多研究表明,各种类型的免疫细胞（例如CD4+Th细胞、巨噬细胞及B细胞）参与了RA的发生与发展。然而,其潜在发病机制机制非常复杂,不仅涉及遗传和环境因素,而且涉及多种细胞之间相互作用,导致目前RA发病的免疫机制尚不十分清楚。CD4+T细胞可显着增强其他细胞（如CD8+T细胞和NK细胞）的效应功能,以消除病原体,但是其过度活化却加速了RA的发病过程。CD4+T细胞在侵袭滑膜组织的炎症细胞中占大部分,并参与了RA病理过程。通过T细胞受体和共刺激分子与各种先天性免疫细胞产生的细胞因子相互作用,幼稚的CD4+T细胞能够分化为功能不同的Th细胞,例如Th1、Th2、Th17、滤泡性Th（Tfh）和调节性T（Treg）细胞。Th1和Th17细胞促进滑膜炎症和破骨细胞形成,最终导致关节破坏,而Th2和Treg细胞改善关节炎的进展。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是长度大约22个核苷酸的单链RNA,主要通过选择性结合靶基因的3’-非翻译区（3’-UTR）的特定位点来抑制蛋白翻译和降解m RNA。据估计,所有m RNA中约60%处于miRNA的控制之下,有些被认为是控制单个或多个细胞途径的主要调控因子。有研究发现微小RNA-10b-5p（MicroRNA-10b-5p,miR-10b）可以通过调节T细胞分化,从而参与炎症相关疾病。但是之前的研究缺乏基因敲除关节炎小鼠模型及体内模型关键治疗证据,因而导致miR-10b在RA发病过程中具体功能和机制不明确。本研究拟首先检测miR-10b在RA患者体内的表达水平和定位,其次利用miR-10b基因敲除小鼠建立胶原抗体诱导性关节炎（Collagen antibody-induced arthritis,CAIA）模型,评价miR-10b在关节炎中的作用,再利用RNA测序和生物信息学预测的方法筛选miR-10b的靶点并体外验证miR-10b及其下游靶基因的功能,最后利用胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）模型,尾静脉给予miR-10b抑制剂,在体内水平评估miR-10b抑制剂的治疗作用。目的:研究miR-10b在RA发病过程中的作用,为RA等自身免疫性疾病的临床治疗提供新的诊疗思路。明确miR-10b在RA患者体内的表达情况,以及miR-10b在体内和体外的生物学功能,阐明miR-10b发挥生物学功能的具体机制,明确其在RA发病过程中扮演的角色,从而为缓解RA等依赖CD4+T细胞调节的自身免疫性疾病提供实验依据。方法:1.利用实时荧光定量PCR和原位杂交技术检测miR-10b在RA患者PBMC和滑膜组织中的表达情况。2.利用5-克隆胶原抗体联合LPS建立miR-10b基因敲除小鼠CAIA模型。记录各组小鼠整体指标（足爪肿胀数、关节炎指数等）变化情况。利用HE染色和番红-O固绿染色评价小鼠膝关节病理变化情况。3.利用RNA转录组测序技术,筛选miR-10b基因敲除与野生型小鼠CAIA模型滑膜和PBMC中的差异基因,并将差异基因进行信号通路分析。利用流式细胞术分选出健康人PBMC和小鼠脾脏CD4+T细胞,分别转染miR-10b的模拟物和抑制剂,转染培养后使用流式细胞术检测CD4+T细胞各亚群的比例变化情况。4.利用miRNA靶基因预测网站并结合miR-10b的功能,预测miR-10b的可能靶点。利用双荧光素酶报告基因技术证明miR-10b与其靶点的直接结合作用,并用免疫印迹法证明miR-10b对其靶点调控作用。利用免疫组化方法检测GATA3和PTEN在RA患者滑膜组织、miR-10b基因敲除和野生型小鼠CAIA模型内表达情况。5.设计miR-10b靶基因的siRNA序列,并使用免疫印迹法筛选敲低效率最优的siRNA序列。将siRNA序列转染到CD4+T细胞中,转染培养后,流式细胞术检测CD4+T细胞各亚群的比例变化情况。6.利用鸡Ⅱ型胶原建立小鼠CIA模型,随机分为正常组、CIA模型组、抑制剂对照组和miR-10b抑制剂组。分别尾静脉注射miR-10b抑制剂、抑制剂序列的对照序列和生理盐水,治疗四周后观察各组小鼠整体指标（关节炎指数、关节肿胀数、足掌厚度、体重等）变化情况,胸腺和脾脏指数变化情况,利用HE染色和番红-O固绿染色评价小鼠膝关节和脾脏病理变化情况。利用X-射线技术,检测CIA软骨磨损和关节畸形的变化情况。利用超声技术,检测膝关节滑膜病理改变和血流信号变化情况。利用免疫组化技术,检测CIA小鼠膝关节内CD4、GATA3和PTEN表达情况,检测脾脏内CD4表达情况。7.流式细胞术检测CIA小鼠PBMC和脾脏内CD4+T细胞各亚群的比例变化情况。结果:1.miR-10b在RA患者体内表达情况RT-q PCR结果显示,与健康对照相比,miR-10b在RA患者PBMC中高表达。FISH结果提示,与健康对照相比,miR-10b在RA滑膜组织中高表达,并且miR-10b主要分布于新生血管部位。2.miR-10b基因敲除对CAIA模型的影响结果显示,miR-10b敲除明显降低CAIA模型小鼠关节炎指数和指关节肿胀数。HE和番红-O固绿染色结果显示,miR-10b敲除明显减少CAIA模型小鼠炎性细胞浸润、血管翳形成、滑膜增厚、炎症、骨和软骨破坏等病理变化情况。3.miR-10b促进CAIA关节炎模型发生与发展的作用机制RNA测序及KEGG信号通路分析结果提示,miR-10b敲除组和野生组的小鼠CAIA模型中,异常表达的基因主要参与调节CD4+T细胞亚群分化。流式细胞术结果提示,miR-10b的模拟物可升高IFN-γ和IL-17A的水平,降低IL-4和Foxp3的水平,而miR-10b的抑制剂则可产生与之相反的作用。4.miR-10b调节CD4+T细胞亚群分化的作用机制生物信息学预测结果显示,miR-10b可能靶向GATA3和PTEN。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-10b可直接结合GATA3和PTEN的3’非编码区。免疫印迹结果显示,miR-10b可抑制GATA3和PTEN蛋白表达。免疫组化结果显示,与健康人的滑膜组织相比,GATA3和PTEN在RA病人的滑膜组织中表达量较低,且未出现在血管和淋巴管位置。另外,与野生型组相比,GATA3和PTEN在miR-10b基因敲除小鼠膝关节滑膜组织中高表达,而在miR-10b野生型中表达量较低。5.GATA3和PTEN siRNA对CD4+T细胞亚群分化的影响根据免疫印迹的结果选出siRNA敲低效率最优的siRNA序列将最优序列转染到人和小鼠CD4+T细胞后,流式细胞术结果显示,GATA3 siRNA可升高IFN-γ水平,而降低IL-4水平,PTEN siRNA可升高IL-17A水平,而降低Foxp3水平。6.miR-10b抑制剂对小鼠CIA模型的治疗作用miR-10b抑制剂可恢复CIA小鼠体重,显着降低CIA模型关节炎指数和关节肿胀数,降低CIA小鼠足爪厚度,改善CIA小鼠膝关节和脾脏的病理改变。X-射线结果显示,miR-10b抑制剂可减少CIA小鼠膝关节磨损、软骨破坏和指关节弯曲变形现象情况。miR-10b抑制剂可明显降低CIA小鼠脾脏指数和胸腺指数,并显着减少CIA小鼠膝关节和脾脏浸润的CD4+T细胞,升高CIA小鼠滑膜组织内GATA3和PTEN的表达。超声结果显示,miR-10b抑制剂可显着减少膝关节滑膜组织和血流信号的改变。流式细胞术结果提示,miR-10b抑制可显着降低IFN-γ和IL-17A水平,显着升高IL-4和Foxp3水平。结论:1.miR-10b在RA患者中高表达。miR-10b在RA患者PBMC和滑膜组织内表达水平较高,并且主要分布于新生血管部位。提示miR-10b可能参与RA的发病过程,并且可能主要在外周血来源的免疫细胞中发挥作用。2.miR-10b基因敲除减弱CAIA模型的严重程度。miR-10b基因敲除明显降低CAIA模型整体指标变化和膝关节病理变化,缓解CAIA模型的发生与发展。miR-10b在CAIA模型中扮演致炎角色,加速关节炎的发病过程。3.miR-10b参与调节CD4+T细胞亚群分化。miR-10b促进人源和小鼠Th1/Th17细胞分化,同时抑制Th2/Treg细胞分化。这说明RA患者体内高表达的miR-10b导致CD4+T细胞亚群比例失衡,从加速关节炎的发生与发展。4.miR-10b导致CD4+T细胞亚群比例失衡的原因是其直接靶向结合GATA3和PTEN的3’非编码区,降低GATA3和PTEN的蛋白的表达,从而影响了CD4+T细胞亚型的分化。5.miR-10b抑制剂对CIA小鼠具有治疗作用。miR-10b抑制剂缓解CIA模型整体指标及病理改变,并可平衡CIA模型小鼠CD4+T细胞的4个亚群比例。本研究为RA的治疗提供了新思路及实验基础。
鲁德玕[5]（2020）在《白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用》文中进行了进一步梳理研究背景:支气管哮喘（哮喘）是以可变和可逆的气流受限以及气道高反应（Airway hyperresponsiveness,AHR）为特征的慢性炎症性疾病。其病理学特征为气道炎症和气道重构。哮喘患者气道重构导致气道高反应,也是肺功能受损、不可逆性气流受限的病理基础。气道重构一般表现为气道壁增厚和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积发生变化,新生血管形成以及气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle,ASM）的增生与肥大。尽管目前的治疗可以有效地控制症状,但是无法防范和控制气道重构。T淋巴细胞（T-lymphocytes）及其细胞因子在哮喘病理过程中起着至关重要的作用。在发病的机制和原因上,哮喘和辅助性T细胞（T helper cells,Th）亚群细胞之间的失衡的免疫应答有关,Th1/Th2失衡是哮喘免疫学发病机制中的一个重要环节。Th1/Th2平衡的精确调节,Th1和Th2细胞涉及的信号下游通路的选择,对于肺脏稳态的维持、气道炎症以及气道重构至关重要。白细胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）为新的IL-12家族的细胞因子,是一个来源不同的二聚体,由EB13和p28两条肽链组成,它们之间以二硫键连接。其受体由gp130和IL-27受体α链（IL-27Rα）组成,IL-27与受体结合可激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子发挥生物学效应。IL-27可以提高Th1免疫应答的程度、减低Th2免疫应答的水平,防止炎症反应向过度方向发展,还可以减低Th17细胞分化的程度及相关的细胞因子的合成和释放,此外,IL-27对调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）也有不同程度的作用,这些都提示IL-27可能在哮喘的病理过程中扮演着重要角色。因此,IL-27可能是一个候选治疗哮喘的细胞因子。研究发现,急性发作期哮喘患者血清IL-27水平发生变化,且与患者肺功能状态相关。Jirmo AC及其同事发现IL-27可以增加干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-y）的分泌,而降低IL-5和IL-13的分泌,显示IL-27对Th2反应有直接抑制作用。他们的发现提供IL-27在抑制过敏性哮喘中具有重要作用的证据。基于卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的小鼠模型,Yoshimoto等人已经证明经鼻给药IL-27可降低OVA诱发的气道高反应性和气道炎症。然而,Su X和同事发现预防性经鼻IL-27给药可减轻气道炎症并改善病理变化,而治疗性IL-27给药却没有以上效应,其原因是气道中已经存在己分化的Th2细胞,且对IL-27介导的Th2发育具有抵抗作用。此外,IL-27是否对哮喘慢性模型的气道重构有作用尚未有研究。目前有关IL-27和哮喘的研究,均着眼于IL-27对气道炎症的影响,没有关注气道重构这个哮喘的病理核心。治疗性给予IL-27是否能够减轻哮喘模型小鼠的气道炎症和气道高反应等病理过程研究结果尚不一致。此外,IL-27通过什么信号途径发挥上述作用尚有争议,目前也没有给予IL-27对气道重构有无影响的文献。目的:探讨预防性应用IL-27以及治疗性应用IL-27是否可以抑制哮喘模型小鼠的气道炎症、气道高反应以及气道重构等病理过程。进一步探讨其发挥上述作用的信号途径。为IL-27作为可能的干预因素针对哮喘气道重构的预防和治疗提供新的可能的靶点。方法:1.6周龄雌性BALB/c小鼠,利用鸡OVA构建急性和慢性哮喘模型。在预防处理组,小鼠随机分为正常对照组（PBS组）、模型组（OVA）组和IL-27预防处理组（OVA+IL-27）;在治疗处理组,小鼠随机分为正常对照组（PBS组）、模型组（OVA）组和IL-27治疗处理组（OVA+IL-27）,每组各8只小鼠。2.收集小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,对BALF进行瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色以及计数细胞总数,以及对中性粒细胞（Neutrophils,Neu）、单核细胞（Monocytes,Mon）、淋巴细胞（Lymphocytes,Lym）、嗜酸性粒细胞（Eosinophils,Eos）、嗜碱性粒细胞（Basophils,Bas）进行分类计数。3.酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）评估小鼠血清及 BALF 上清中 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 和 IFN-γ 的含量。4.应用有创的肺功能分析系统测定气道阻力和气道顺应性。5.实时聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction amplification,Real-time PCR）检测小鼠肺脏组织中 ST AT1、STAT3、GAT A-binding protein-3（GATA-3）mRNA 和 T 细胞表达的转录因子 T-box（Transcription factors T-box expressed in T-cells,T-bet）mRNA 表达情况。6.Western blot 检测小鼠肺脏组织中 STAT1、磷酸化 STAT1（Phosphorylated STAT1,p-STAT1）、STAT3、p-STAT3、GATA3 和 T-bet 蛋白表达情况。同时计算p-STAT1和STAT1以及p-STAT3和STAT3的比值。7.采用不同染色方法评估肺组织气道重构情况:（1）采用H&E染色（Hematein eosin staining）方法,图像分析软件测量气道壁的面积（Area of airway wall,Wat）、平滑肌面积（Area of smooth muscle,Warm）、基底膜周长（Perimeter of basement membrane,Pbm）,用 Wat/Pbm（μm2/μm）和 Wam/Pbm（μm2/μm）,评估气道壁增厚、平滑肌增生情况。（2）采用 Masson 染色（Masson’s trichrome staining）方法,图像分析软件测量基底膜下蓝色胶原沉积面积,得到Masson+面积/Pbm,评估胶原沉积程度。（3）采用过碘酸-希夫（Periodic acid-Schiff,PAS）染色方法,图像分析软件测量PAS阳性面积,得到PAS+面积/Pbm（μm2/μm）,评估杯状细胞增生情况。（4）采用免疫组化α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）染色方法,图像分析软件测量α-SMA 阳性面积,得到α-SMA+面积/Pbm（μm2/μm）,评估肌成纤维细胞活化情况。（5）采用免疫组化CD31染色方法,图像分析软件测量CD31阳性面积,得到CD31+新生血管面积/Pbm（μm2/μm）,评估气道壁血管新生情况。结果:1.OVA诱导的哮喘小鼠模型临床表现哮喘模型组（OVA组）小鼠吸入OVA后即时出现明显的哮喘发作症状:烦躁不安,呼吸急促,腹肌抽搐,活动频繁,大、小便失禁,毛发竖起,部分小鼠出现可听到的哮鸣音,反应迟钝,动作迟缓等异常表现。这些表现均提示小鼠哮喘造模成功。2.小鼠BALF中细胞总数和分类2.1小鼠BALF中细胞总数2.1.1 IL-27在预防处理组可降低小鼠BALF中细胞总数三组小鼠BALF中细胞总数（X 104 cells/ml）有显着统计学差异（PBS组:8.38±1.94,OVA 组:190.70±29.77,OVA+IL-27 组:99.94±17.31,F=167.60,P<0.001,one-way ANOVA）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中细胞总数明显减少（t=9.11,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。2.1.2 IL-27在治疗处理组不能减少小鼠BALF中细胞总数三组小鼠BALF中细胞总数（X 104 cells/ml）有明显统计学差异（PBS组:8.59±2.07,OVA 组:193.50±40.35,OVA+IL-27 组:152.50±40.31,F=69.52,P<0.001,one-way ANOVA）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中细胞总数无明显变化（t=2.49,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。2.2小鼠BALF中细胞分类2.2.1 IL-27在预防处理组可降低小鼠BALF中不同炎症细胞数三组小鼠 BALF 中 Mon 数（× 104 cells/ml）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:4.53±1.77 vs 17.82±5.18 vs 10.40±2.36,F=29.95,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、Eos 数（0.47±0.25 vs 61.99±19.77 vs 17.22±4.36,F=59.26,P<0.001）、Neu 数（2.31±1.04 vs 27.79±6.17 vs 15.91±4.34,F=67.20,P<0.001）、Lym数（1.01±0.39 vs 74.97±16.53 vs 49.84±10.64,F=87.81,P<0.001）和 Bas 数（0.37±0.08 vs 6.03±1.76 vs 1.89±0.49,F=61.51,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠 BALF 中 Mon 数（t=4.31,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Eos 数（t=7.66,P<0.001）、Neu 数（t=5.40,P<0.001）、Lym数（t=4.43,P<0.001）和 Bas 数（t=7.83,P<0.001）明显减少。2.2.2 IL-27在治疗处理组不能减少小鼠BALF中不同炎症细胞数三组小鼠 BALF 中 Mon 数（×104 cells/ml）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:4.70±1.59 vs 18.01 ±6.35 vs 13.56±5.14,F=16.01,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、Eos数（0.50±0.25 vs 62.32±20.52 vs 52.78±13.33,F=44.38,P<0.001）、Neu 数（2.34±1.06 vs 28.17±5.78 vs 24.15±4.80,F=80.58,P<0.001）、Lym数（0.97±0.35 vs 78.23±15.32 vs 69.44±19.56,F=69.54,P<0.001）和 Bas 数（0.38±0.11 vs 6.23±2.19 vs 4.77±1.59,F=30.18,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠 BALF 中 Mon 数（t=1.87,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Eos 数（t=1.35,P>0.05）、Neu 数（t=1.83,P>0.05）、Lym数（t=1.23,P>0.05）和 Bas 数（t=1.87,P>0.05）无明显改变。3.小鼠的AHR测定3.1 IL-27降低预防处理组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性三组小鼠气道基线反应无明显差异。当乙酰甲胆碱浓度为20 mg/ml激发时,与PBS组相比,OVA组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性明显增强。表现为气道阻力（Airway resistance,R）增加（2.93±0.17 vs 5.10±0.19,F=285.30,P<0.001,one-way ANOVA;t=9.14,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,肺动态顺应性（Lung dynamic compliance,Cdyn）下降（0.48±0.02 vs 0.29±0.03,F=171.70,P<0.001,one-way ANOVA;t=10.19,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性显着下降。表现为当乙酰胆碱浓度为20 mg/ml激发时,R下降（5.10±0.19 vs 4.26±0.19,F=285.30,P<0.001,one-way ANOVA;t=9.14,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,Cdyn 上升（0.29±0.03 vs 0.39±0.02,F=171.70,P<0.001,one-way ANOVA;t=10.19,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。3.2 IL-27不能改善治疗处理组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性三组气道基线反应无明显差异。当乙酰甲胆碱浓度为20 mg/ml激发时,与PBS组相比,OVA组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性明显增强。表现为R增加（2.94±0.44 vs 5.02±0.20,F=111.10,P<0.001,one-way ANOVA;t=14.00,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,Cdyn 下降（0.49±0.02 vs 0.29±0.03,F=175.80,P<0.001,one-way ANOVA;t=17.37,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性无显着改变。表现为当乙酰胆碱浓度为20 mg/ml激发时,R无明显变化（5.02±0.20 vs 4.64±0.18,F=111.10,P<0.001,one-way ANOVA;t=2.56,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,肺 Cdyn 无明显变化（0.29±0.03 vs 0.32±0.02,F=175.80,P<0.001,one-way ANOVA;t=2.56,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。4.急性哮喘模型小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量4.1 IL-27在预防处理组降低小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,提高IFN-γ水平三组小鼠 BALF 上清中 IL-4 含量（pg/m1）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:60.03±13.34 vs 134.20±26.59 vs 101.60±21.90,F=24.30,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5含量（39.33±9.75 vs 84.52±14.70 vs 62.68±12.97,F=25.58,P<0.001）、IL-13 含量（122.90±26.79 vs 369.50±100.40 vs 244.60±68.97,F=23.48,P<0.001）、IL-17 含量（67.61±12.13 vs 203.50±38.32 vs 142.20±22.99,F=51.84,P<0.001）和 IFN-γ 含量（80.22±18.45 vs 39.99±9.21 vs 59.87±14.82,F=15.06,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中IL-4（t=3.06,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=3.46,P<0.05）、IL-13（t=3.47,P<0.05）、IL-17（t=4.59,P<0.01）水平明显下降,IFN-γ水平明显增加（t=2.71,P<0.05）。4.2 IL-27在治疗处理组不影响小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ水平三组小鼠 BALF 上清中 IL-4 含量（pg/mI）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:58.96±15.47 vs 130.00±30.39 vs 104.60±26.14,F=16.84,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5 含量（39.80±11.32 vs 79.61±23.60 vs 63.87±18.53,F=9.38,P<0.001）、IL-13 含量（117.50±34.18 vs 380.00±87.13 vs 285.20±87.69,F=25.77,P<0.001）、IL-17 含量（68.25±17.66 vs 215.80±46.22 vs 177.20±26.43,F=44.66,P<0.001）和 IFN-γ 含量（79.99±20.53 vs 47.60±17.49 vs 56.82±17.34,F=6.50,P<0.05）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中 IL-4（t=2.05,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=1.70,P>0.05）、IL-13（t=2.56,P>0.05）、IL-17（t=2.39,P>0.05）水平无明显下降,IFN-γ水平无明显增加（t=0.99,P>0.05）。5.急性哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量5.1 IL-27在预防处理组降低小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,提高IFN-γ水平三组小鼠血清中IL-4含量（pg/ml）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:24.21±8.74 vs 110.60±20.39 vs 66.98±17.00,F=57.36,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5含量（24.23±8.15 vs 82.87±18.42 vs 53.97±12.36,F=36.96,P<0.001）、IL-13 含量（156.80±33.10 vs 416.40±92.41 vs 269.70±77.54,F=25.98,P<0.001）、IL-17 含量（44.45±12.70 vs 154.5±27.24 vs 101.80±21.03,F=53.99,P<0.001）和 IFN-γ 含量（58.81±9.05 vs 32.76±9.55 vs 50.08±10.28,F= 15.13,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠血清中IL-4（t=5.41,P<0.01,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=4.24,P<0.01）、IL-13（t=4.06,P<0.05）、IL-17（t=4.98,P<0.01）)水平明显下降,IFN-γ 水平明显增加（t=3.59,P<0.01）。5.2 IL-27在治疗处理组不影响小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ水平三组小鼠血清中IL-4含量（pg/ml）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:26.25±12.01 vs 100.40±28.67 vs 80.58±24.13,F=22.74,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、IL-5 含量（26.86±9.26 vs 79.57±19.31 vs 61.55±15.80,F=24.31,P<0.001）、IL-13 含量（149.90±39.42 vs 439.40±101.10 vs 345.40±112.20,F=21.48,P<0.001）、IL-17 含量（46.00±15.44 vs 157.70±37.82 vs 126.50±33.26,F=28.75,P<0.001）和 IFN-γ 含量（59.96±12.06 vs 33.84±12.47 vs 44.84±12.39,F=9.07,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠血清中IL-4（t=1.74,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=2.35,P>0.05）、IL-13（t=2.09,P>0.05）、IL-17（t=2.05,P>0.05）水平无明显下降,IFN-γ水平无明显增加（t=1.79,P>0.05）。6.小鼠肺组织 STAT1、STAT3、T-bet 和 GATA3 mRNA 的表达6.1 IL-27在预防处理组可提高小鼠肺组织中STAT1 mRNA和T-bet mRNA、降低GATA3 mRNA表达水平三组小鼠肺组织中STAT1 mRNA表达水平有明显统计学差异（PBS组vs OVA 组 vs OVA+IL-27 组,下同:0.94±0.21 vs 0.67±0.19 vs 1.04±0.32,F=4.61,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、GAT A3 mRNA 表达水平（1.15±0.39 vs 5.06±0.83 vs 2.93±0.90,F=55.30,P<0.01）和 T-bet mRNA 表达水平（0.97±0.29 vs 0.31±0.11 vs 0.62±0.25,F=16.83,P<0.001）有显着统计学差异。STAT3 mRNA表达水平（0.99±0.25 vs 0.73±0.24 vs 0.88±0.25,F=2.14,P>0.05）无明显统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 STAT1 mRNA（t=2.94,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）和 T-bet mRNA（t=2.72,P<0.05）表达水平提高,GATA3 mRNA表达水平下降（t=5.73,P<0.01）,STAT3m RNA表达水平无明显变化（t=1.21,P>0.05）。6.2 IL-27在治疗处理组对于小鼠肺组织中STAT1 mRNA、STAT3 mRNA、T-bet mRNA和GATA3 mRNA表达水平无影响三组小鼠肺组织中STAT1 mRNA（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:1.04±0.23 vs 0.94±0.13 vs 1.03±0.16,F=0.74,P>0.05）和 STAT3 mRNA 表达水平（1.00±0.25 vs 0.79±0.33 vs 0.88±0.23,F=1.26,P>0.05）表达水平无明显统计学差异。GATA3 mRNA 表达水平（0.98±0.34 vs 5.56± 1.42 vs 4.37±1.36,F=34.04,P<0.01）和 T-bet mRNA 表达水平（0.96±0.29 vs 0.45±0.14 vs 0.64±0.22,F=9.85,P<0.01）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠肺组织中STAT1 mRNA（t=0.98,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、STAT3 mRNA（t=0.67,P>0.05）、GATA3 mRNA（t=2.07,P>0.05）和 T-bet mRNA（t=1.62,P<0.05）表达水平无明显变化。7.小鼠肺组织STAT1、磷酸化STAT1、STAT3、磷酸化STAT3、T-bet和GATA3蛋白的表达7.1 IL-27在预防处理组可提高小鼠肺组织中STAT1、p-STAT1、p-STAT3和T-bet蛋白表达水平,降低GATA3蛋白表达水平以β-actin作为内参,三组小鼠肺组织中STAT1（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:0.42±0.17 vs 0.39±0.13 vs 0.63±0.22,F=4.24,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、磷酸化 STAT1（p-STAT1）（0.99±0.21 vs 0.49±0.11 vs 0.76±0.13,F=31.62,P<0.01）、p-STAT3 表达水平（1.15±0.25 vs 0.40±0.17 vs 0.96±0.31,F=19.64,P<0.01）、T-bet 表达水平（0.80±0.12 vs 0.34±0.11 vs 0.50±0.09,F=16.83,P<0.001）和 GATA3 表达水平（1.19±0.24 vs 3.12±0.95 vs 2.03±0.40,F=19.95,P<0.001）以及比值p-STAT1/STAT1（2.61±0.79 vs 1.04±0.30 vs 1.78±0.53,F=15.45,P<0.01）和 p-STAT3/STAT3（1.85±0.53 vs 0.69±0.33 vs 1.36±0.38,F=15.59,P<0.01）均有显着统计学差异。而STAT3表达水平无明显统计学差异（0.65±0.15 vs 0.63±0.19 vs 0.69±0.20,F=0.99,P>0.05）。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 STAT1（t=2.63,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、p-STAT1（t=4.83,P<0.01）、p-STAT3（t=4.54,P<0.01）和T-bet（t=2.72,P<0.05）蛋白表达水平提高,比值 p-STAT1/STAT1（t=2.69,P<0.05）和 p-STAT3/STAT3（t=3.21,P<0.05）均升高,GATA3 蛋白表达水平下降（t=3.56,P<0.05）,STAT3蛋白表达水平无明显变化（t=0.18,P>0.05）。7.2 IL-27在治疗处理组不改变小鼠肺组织中STAT1、p-STAT1、GATA3和T-bet蛋白表达水平三组小鼠肺组织中STAT1蛋白（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:0.45±0.17 vs 0.41±0.12 vs 0.49±0.13,F=0.92,P>0.05,one-way ANOVA,下）和STAT3 蛋白（0.71±0.21 vs 0.68±0.23 vs 0.74±0.18,F=0.13,P>0.05）表达水平以及比值 p-STAT1/STAT1（2.83±1.79 vs 1.50±0.96 vs 1.52±0.80,F=2.92,P>0.05）和p-STAT3/STAT3（1.56±0.51 vs 1.36±0.85 vs 1.42±0.54,F=0.19,P>0.05）无显着统计学差异。p-STAT1 蛋白（1.04±0.26 vs 0.53±0.21 vs 0.70±0.28,F=8.46,P<0.01）、p-STAT3 蛋白（15±0.25 vs 0.76±0.11 vs 0.98±0.20,F=7.87,P<0.01）、T-bet 蛋白（0.79±0.14 vs 0.41±0.12 vs 0.56±0.14,F=17.15,P<0.001）和 GATA3蛋白（1.25±0.32 vs 3.46±0.83 vs 2.69±0.66,F=24.45,P<0.001）表达水平有显着统计学差异。与 OVA组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 p-STAT1 蛋白（t=1.34,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、p-STAT3 蛋白（t=2.23,P>0.01）、T-bet 蛋白（t=2.27,P>0.05）和 GATA3 蛋白（t=2.41,P>0.05）表达水平以及比值 p-STAT1/STAT1（t=0.02,P>0.05）和 p-STAT3/STAT3（t=0.19,P>0.05）无明显变化。8.IL-27对慢性小鼠哮喘模型气道重构的影响8.1 IL-27在预防处理组可以改善预防处理组慢性小鼠哮喘模型气道重构三组小鼠肺组织H&E染色测量Wat/Pbm（μm2/μm）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:3.59±1.42 vs 8.49±2.86 vs 5.38±2.21,F=9.78,P<0.001,one-way ANOVA,下同）和 Wam/Pbm（μm2/μm）（10.22±4.02 vs 24.87±6.44 vs 17.00±5.77,F=14.20,P<0.001）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm的比值以（μm2/μm）（1.25±0.41 vs 3.79±0.97 vs 2.39±0.92,F=19.84,P<0.001）、PAS 染色阳性染色面积和 Pbm 的比值（μm2/μm）（0.36±0.18 vs 3.06±1.53 vs 1.31±0.92,F=14.05,P<0.001）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm的比值（μm2/μm）（0.69±0.32 vs 2.74±1.21 vs 1.56±0.75,F=11.92,P<0.001）和 CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm的比值（μm2/μm）（0.002±0.001 vs 0.37±0.15 vs 0.19±0.12,F=22.50,P<0.001）有明显统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组模型小鼠 H&E 染色 Wat/Pbm（t=2.77,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Wam/Pbm（t=2.86,P<0.05）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm 比值（t=3.45,P<0.05）、PAS染色每um的PAS染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=3.37,P<0.05）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=2.79,P<0.05）以及CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm（t=3.32,P<0.05）明显减小。8.2 IL-27在治疗处理组不能改善治疗处理组慢性小鼠哮喘模型气道重构三组小鼠肺组织H&E染色测量Wat/Pbm（μm2/μm）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:3.91±1.81 vs 9.13±3.49 vs 6.61±2.38,F=7.75,P<0.01,one-way ANOVA,下同）和 Wam/Pbm（μm2/μm）1131±5.19 vs 26.27±10.23 vs 19.72±6.34,F=7.85,P<0.05)、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm比值（μm2/μm）（1.21±0.35 vs 3.82±1.24 vs 3.09±0.99,F=16.36,P<0.001）、PAS 染色阳性染色面积和 Pbm 比值（μm2/μm）（0.40±0.20 vs 3.53±1.55 vs 2.80±1.18,F=16.66,P<0.001）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（μm2/μm）（0.73±0.34 vs 3.30±1.58 vs 2.37±1.46,F=8.58,P<0.001）和 CD31 免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（μm2/μm）（0.001±0.001 vs 0.40±0.16 vs 0.29±0.15,F=21.48,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27组模型小鼠 H&E 染色 Wat/Pbm（t=1.91,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Wam/Pbm（t=1.73,P>0.05）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm 比值（t=1.57,P>0.05）、PAS染色每um的PAS染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.28,P>0.05）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.48,P>0.05）以及CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.72,P>0.05）无明显改变。结论:1.IL-27可增强哮喘模型小鼠的Th1型免疫应答,抑制其Th2型免疫应答,改善Th1/Th2细胞因子平衡。2.预防性经鼻吸入IL-27通过STAT1和STAT3信号途径抑制哮喘模型小鼠的气道炎症、气道高反应和气道重构等病理过程。3.IL-27有望成为哮喘的预防和治疗的一个靶点。
马占川[6]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中认为研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
陈一方[7]（2020）在《桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种非特异性炎症性肠道疾病,主要包括克罗恩病（Crohn’s disease,CD）和溃疡性炎症性肠病（Ulcerative colitis,UC）两种疾病形式,此病在欧美国家多发,截至2015年,美国IBD患者数量已超过100万,欧洲超过250万,欧美等发达国家IBD发病率高达0.5%。近十年发现,亚洲、中东及南美等地区的新兴工业化国家IBD发病率也持续增加。由于新兴工业化国家发病率及人口总量急剧增长,预测至2025年,IBD患者总量将与西方国家人口总量相持平,IBD将成为新的全球性负担。IBD多发病于青壮年时期,致病因素尚不明确,多认为与易感基因突变、环境的改变、肠道菌群失衡及免疫应答异常等有关,致病因素的不确定性及多样性加剧了 IBD的治疗难度,其中免疫功能紊乱及免疫应答异常,被认为是引起IBD发病的主要因素,也是靶向治疗IBD的主要目标。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是功能最强大的专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cell,APC）,是连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”,通过自身耐受性及分泌的特异性细胞因子的不同,调控CD4+T细胞分化为不同的辅助T细胞（T helper cells,Th）或调节性 T 细胞（Regulatory cells,Treg）,使免疫系统发挥免疫激活或免疫耐受作用,进而参与包括IBD在内的多种自身免疫性疾病的发生与发展。CD4+T细胞主要由Th细胞亚群和Treg细胞亚群组成,IBD患者结肠组织往往伴随大量CD4+T细胞的浸润,最初认为Th1/Th2细胞分化失衡是介导IBD发病的主要机制,Th1细胞的过度活化使促炎因子IFN-γ大量表达,抑制IL-4依赖性的Th2细胞的分化,使Th1/Th2细胞轴产生严重偏移,加剧炎症反应,进而在IBD中发挥致病作用。随着IL-17分泌性Th17细胞亚群在IBD患者中检出,Th17细胞在IBD中的致病作用被逐步确定,补充了 Th1/Th2细胞失衡致病的理论。Th17细胞通过分泌促炎因子IL-17参与炎症反应,介导剧烈的组织损伤,其分化呈IL-6依赖性。IL-6抑制TGF-β依赖性亚群Treg细胞的分化,Treg细胞数量不足或功能受损也是IBD发病的机制之一,因此Th17/Treg细胞的分化失衡,成为介导IBD的新型机制,并被广泛探究。目前,IBD的治疗方案主要集中在药物治疗,主要包括氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、单抗药物,及其他选择性药物如抗生素、益生菌、维生素及罗格列酮等。随着细胞分子医学及免疫学的深入研究,更多的IBD机制及药物靶点被发现,使IBD的治疗药物及治疗方式呈现多元化开发。然而目前IBD仍然难以被根治,复发率极高,且治疗药物价格昂贵、用药周期长、不良反应等因素,促使研究人员不断探索新的安全、高效、平价的IBD治疗药物或治疗手段。研究目的:桦褐孔菌又称白桦茸,是生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下的一种可食用真菌,多分布于北纬40-50°的寒冷地带,如我国黑龙江省、吉林省长白山等地区,欧洲国家早在16世纪便利用其治疗恶性肿瘤、糖尿病、炎症等难治性疾病。桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharide,IOP）是由桦褐孔菌提取的最具有药用价值的活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生物活性,但其对葡聚糖硫酸钠（Dextran sulphate sodium,DSS）诱导的实验性结肠炎的治疗作用及相关机制尚不明确。因此本研究采用不同浓度的IOP探索其对DSS诱导的急、慢性结肠炎的治疗作用,并探索其与DC及CD4+T细胞相关的治疗机制,为IOP治疗IBD提供可行性及理论依据,并通过IOP诱导的耐受性骨髓来源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）的体内回输,为IBD免疫细胞治疗提供新的可能性。第一部分IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用研究方法:采用热水浸提法提取IOP,并采用高效液相检测IOP的单糖组成。BALB/c雄性6-8周龄小鼠给予3%DSS三次循环共43天造模法建立慢性结肠炎模型,实验组给予三种不同浓度IOP（100,200,300mg/kg）处理,每日检测小鼠体重、粪便性状、便血情况,并进行疾病活动指数（Disease active index,DAI）评分。第44天脱颈法处死小鼠,测量小鼠结肠长度,评估小鼠肠道炎症严重程度。小鼠结肠石蜡切片进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色并进行组织学评分,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）法检测小鼠结肠组织中带状闭合蛋白（Zonula occludens-1 protein,ZO-1）、Occludin这两种紧密连接（Tightjunction,TJ）蛋白的表达,观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况;逆转录-聚合链酶反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测小鼠结肠组织中与Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞相关的特异性细胞因子及转录因子的基因水平表达情况。流式细胞术检测小鼠脾脏及肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）中 Th1 细胞、Th2 细胞、Th17 细胞、Treg细胞的分化情况。IHC及免疫印迹（Western blot,WB）法检测与CD4+T细胞分化相关的JAK-STAT信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、STAT6在结肠组织中的表达情况。研究结果:经高效液相法检测,我们所提取的IOP主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成,含量分别为9.2%、4.4%、46.6%、11.5%、11.1%、4.3%。糖度仪检测多糖含量大于90%,适用于后续研究。与模型组相比,IOP（100,200,300 mg/kg）治疗组小鼠体重变化率较小,结肠长度明显恢复,DAI及组织学评分显着降低,肠道炎症情况得到明显改善,结肠组织TJ蛋白ZO-1及Occludin丢失较少,显着保护了结肠组织通透性及完整性。RT-PCR结果显示,IOP（100,200,300 mg/kg）使结肠组织中Th1细胞、Th17细胞相关促炎因子IFN-y、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-yt表达量下降,使Th2细胞、Treg细胞相关抑炎因子IL-4、IL-10及特异性转录因子GATA-3、Foxp3表达量上升。同时,IHC及WB结果表明,IOP（100,200,300 mg/kg）对CD4+T细胞分化相关的上游通路JAK-STAT信号通路具有调控作用,使STAT1及STAT3的磷酸化水平下调,入核量减少,STAT6的磷酸化水平上调,入核量增多。流式细胞术结果表明,IOP（100,200,300 mg/kg）可以显着抑制脾脏及MLN中Th1细胞及Th17细胞的分化,促进Th2细胞及Treg细胞的分化,使结肠炎小鼠体内Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞轴趋向平衡。研究结论:1.我们所提取的IOP（100,200,300mg/kg）可以显着缓解DSS诱导的慢性结肠炎的炎症情况。2.IOP（100,200,300 mg/kg）对实验性结肠炎的治疗作用与调控Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞的分化平衡有关。3.IOP（100,200,300 mg/kg）CD4十T细胞亚群的分化的作用可能与STAT1、STAT3、STAT6等蛋白的调控有关。第二部分IOP对CD4+T细胞体外分化的影响研究方法:为探索IOP对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞分化过程的影响,CD4+免疫磁珠阴性分选法获取C57BL/6雄性小鼠脾脏CD4+T细胞,活细胞荧光染料CFSE（2 μM）进行标记后,将细胞平均分为CD4+T组、对照组、IOP（10,20,40mg/mL）三种剂量组（即 IOP-L、IOP-M、IOP-H）,除 CD4十T 组外,均给予抗鼠CD3ε抗体（5μg/mL）及抗鼠CD28抗体（3μg/mL）刺激活化三天。流式细胞术检测IOP（L,M,H）分别对CD4+T细胞活化标志CD69、CD25的影响,以及对CD4+T细胞增殖率及增殖指数的影响。RT-PCR法检测Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及特异性转录因子T-bet、GATA-3、ROR-yt、Foxp3基因水平的表达情况。酶联反应吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测 IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10蛋白水平的分泌情况。对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞三种细胞亚群给予定向分化,同时给予IOP（L,M,H）处理,流式细胞术检测IOP（L,M,H）对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率的影响。研究结果:结果显示,与对照组相比,IOP（L,M,H）并不影响CD4+T细胞前期及后期的活化指标CD69、CD25的表达量,细胞的增殖率及增殖指数也未产生显着差异,提示IOP（L,M,H）可能并不作用于CD4+T细胞活化及增殖过程。RT-PCR结果显示,IOP（L,M,H）使活化的CD4+T细胞中,Th1细胞及Th17细胞相关的促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt的表达量明显降低,Treg相关的抑炎因子IL-10及特异性转录因子Foxp3的表达量明显上调,而对Th2细胞相关细胞因子IL-4及转录因子GATA-3作用较为局限。ELISA结果显示,IFN-γ、IL-17表达量下调,IL-10表达量上调。Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞定向分化实验结果显示,IOP（L,M,H）使Th1细胞、Th17细胞分化率显着下调,使Treg细胞的分化率显着上调,IOP（L,M,H）对CD4+T细胞分化阶段具有直接调控作用。研究结论:1.IOP（L,M,H）并不参与CD4+T细胞的活化及增殖阶段,而是对其分化阶段产生直接调控作用。2.在体外,IOP（L,M,H）可以抑制Th1细胞、Th17细胞的分化,促进Treg细胞的分化,但是对Th2细胞的分化具有局限性。第三部分IOP对BMDC成熟度及功能的影响研究方法:DC是刺激CD4+T细胞分化的最重要的APC,其表面MHC-Ⅱ、共刺激分子的表达以及分泌细胞因子类型对CD4十T细胞的分化方向起绝对作用,DC成熟度的不同是决定其介导免疫耐受或免疫应答的关键,因此,我们在体外实验中探讨IOP对BMDC成熟度的影响,以及对BMDC诱导免疫耐受能力的影响。取C57BL/6雄性6-8周龄小鼠大腿骨骨髓细胞,以2 × 106个/孔铺于六孔板,并给予 rmGM-CSF（20ng/mL）、rmIL-4（20ng/mL）刺激分化 6 天,第 7 天收集板中悬浮及半悬浮细胞即为BMDC。采用100ng/mL脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）刺激BMDC24小时,使BMDC活化并成熟,即为BMDCLPS细胞,部分BMDCLPS细胞分别给予IOP（10,20,40 mg/mL）即IOPL,M,H处理。流式细胞术检测BMDC成熟度相关指标MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表达情况,ELISA检测以及与诱导Th1细胞、Th17细胞和Treg细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。取不同处理的BMDC与CD4+T细胞以1:5的比例共同培养,总细胞量2 × 106个/孔铺于六孔板中,建立混合淋巴反应（Mixed lymphocyte reaction,MLR）体系,流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率,ELISA检测MLR体系中与此三种细胞分化启动相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。研究结果:MHC-Ⅱ及表面共刺激分子CD40、CD86等的表达量是判断DC成熟与否的标志,同时也是激活CD4+T细胞的第一、二信号,流式细胞术结果显示,与未进行活化刺激的BMDC相比,BMDCLPS表面高表达MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD40、CD86,成熟度显着升高。ELISA及流式细胞术检测显示,BMDCLPS分泌与Th1细胞、Th17细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6明显增高,并使CD4+T细胞向Th1细胞、Th17细胞方向分化率显着上调,MLR体系整体呈现免疫激活状态。而 IOPL,M,H-BMDCLPS组与 BMDCLPS相比,MHC-Ⅱ、CD40 及 CD86 的表达量均明显下降,成熟度显着降低,且TGF-β的分泌量明显提升,使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化比率显着上调,使MLR体系呈现免疫耐受状态。研究结论:1.IOPL,M,H使BMDCLPS维持低成熟状态。2.IOPL,M,H-BMDCLPS使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化,具有维持免疫耐受的功能。第四部分IOPL-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用研究方法:各种功能稳定的免疫耐受性DC被应用到结肠炎模型的治疗中,并验证具有显着的治疗效果,耐受性DC是IBD细胞治疗的重要细胞来源,因此我们探索IOP诱导的耐受性BMDC是否可以通过调控CD4+T细胞的分化,诱导机体免疫耐受,从而达到治疗结肠炎的作用。C57BL/6雄性6-8周龄小鼠采用3%DSS 6天造模法建立急性小鼠结肠炎模型,分为对照（Control）组、模型（DSS）组、BMDC组及IOPL-BMDC组,其中BMDC组及IOPL-BMDC组在给予3%DSS饮用水的前3天及第3天分别给予2 × 106个/只BMDC或IOPL-BMDC腹腔注射,并每日检测各组小鼠生存率、体重、是否便血及腹泻情况,并进行DAI评分。第7天断颈处死小鼠,测量小鼠结肠长度并拍照,评估小鼠肠道受损情况。结肠组织石蜡切片进行HE染色观察结肠组织完整性相关指标并进行组织学评分。IHC法检测小鼠结肠组织TJ蛋白ZO-1和Occludin的表达量,观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况。取小鼠脾脏及MLN,流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化情况。ELISA法检测小鼠结肠组织匀浆上清液中与CD4+T细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-10的分泌情况。研究结果:BMDC及IOPL-BMDC的体内回输,使结肠炎小鼠体重变化率及DAI评分明显降低,恢复因炎症造成的结肠短缩,生存率得到明显改善,小鼠炎症程度得到显着控制。HE及IHC结果显示,与模型组相比,BMDC及IOPL-BMDC组小鼠结肠组织杯状数量增多,隐窝完整,组织完整性得到改善,TJ蛋白ZO-1、Occludin的流失减少,黏膜损伤程度明显降低,且以IOPL-BMDC抗炎效果更为显着。ELISA结果显示,IOPL-BMDC显着抑制与Th1细胞及Th17细胞分化相关的促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌,提高Treg分化相关的抗炎因子TGF-β、IL-10的分泌。流式细胞术结果显示,Th17细胞亚群在正常组小鼠及结肠炎小鼠脾脏及MLN中的分化均不明显,模型组高表达促炎性T细胞亚群Th1细胞,低表达抗炎性T细胞亚群Treg细胞,给予BMDC及IOPL-BMDC回输治疗后,结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1细胞亚群分化率明显降低,而Treg细胞亚群分化率显着提升,其中以IOPL-BMDC组对CD4+T细胞亚群调控能力最为显着。研究结论:1.IOPL-BMDC可以通过调控结肠炎小鼠CD4+T细胞的分化缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病。2.IOPL-BMDC为炎症性肠病的细胞治疗提供新的可能性,为耐受性DC的制备提供新的思路。结论:不同剂量IOP（100,200,300 mg/kg）均可显着改善DSS诱导的慢性结肠炎小鼠疾病进程,调控结肠炎小鼠脾脏、MLN及结肠组织中Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群平衡,这种调控作用可能与JAK-STAT信号通路有关。不同浓度IOP（10,20,40 mg/mL）均不影响体外的脾脏来源的CD4+T细胞增殖及活化,对分化具有直接调控作用,抑制Th1细胞、Th17细胞分化,促进Treg细胞分化,对Th2细胞的分化调控具有局限性。IOPL,M,H均可维持LPS（100 ng/mL）诱导的炎性环境下BMDC的低成熟状态,并促进MLR反应体系中CD4+T细胞向Treg细胞方向分化,抑制Th1细胞及Th17细胞的分化。IOPL-BMDC显着缓解DSS诱导的急性炎症性肠病,并调控结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4+T细胞亚群分化,抑制Th1细胞分化,促进Treg细胞分化,对Th17细胞分化具有一定局限性。
闫成兰[8]（2020）在《CD4+CD25+Foxp3+T细胞在炎性肌病发病及疗效评估中的意义》文中研究指明目的:1.分析PM/DM患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达,探讨其在PM/DM发病中的意义;2.探索CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM患者临床特征的关系;3.分析PM/DM患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞与血清学及免疫学指标的关系,探讨其在PM/DM病情评估中的意义;4.分析CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM患者肌肉磁共振成像（MRI）异常表现的关系,探讨其联合MRI对PM/DM诊断和疾病评估的价值;5.比较PM/DM患者治疗前后CD4+CD25+Foxp3+T细胞的动态改变,探讨其在疗效评估中的意义。方法:1.选取DM患者155例、PM患者29例及193例健康对照。详细记录患者临床资料,包括患者年龄、性别、病程和主要临床表现,包括器官受累（肺部、心脏和消化道）情况;记录患者及健康对照实验室检查结果,包括ESR、CRP、CK、CKMB、LDH、HBDH。流式细胞术检测患者及健康对照外周血淋巴细胞亚群及CD4+T细胞亚群的百分比及绝对计数。2.使用流式微球捕获芯片技术（CBA）检测35例PM/DM患者和30例健康对照外周血细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ、IL-17A、TNF-α的水平。检测了159例患者的ANA,140例患者检测了肌炎抗体谱。3.对65例PM/DM患者进行双侧大腿肌肉磁共振扫描。利用快速自旋回波（FSE）序列进行T1/T2加权和短tau反转恢复（STIR）脂肪抑制T2加权成像。脂肪成像采用GRE序列。4.53例PM/DM患者分成两组,26例患者接受传统治疗（糖皮质激素+DMARDs）,27例患者在传统治疗基础上给予小剂量IL-2治疗,在治疗的0W、1W、12W随访并检测相关血清学和免疫学等指标。结果:1.与健康对照相比,DM和PM患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞的百分比和绝对计数均明显降低（P<0.001）,Th17/Treg比值增高（P<0.01）。同时总T、CD4+T、CD8+T、NK及Th1、Th17细胞的绝对数量也低于健康对照,差异有统计学意义。2.DM和PM患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平与病程呈负相关,Th17/Treg比值与病程呈正相关（P<0.05）。CD4+CD25+Foxp3+T细胞与DM/PM患者性别、发病年龄均无相关性。3.PM/DM患者中,器官受累组CD4+CD25+Foxp3+T细胞和Th1细胞百分比及绝对数量均低于无器官受累组,器官受累组Th17/Treg比值高于无器官受累组,均有统计学差异（P<0.05）。4.PM/DM患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞绝对计数与ESR、CK、CKMB、LDH、HBDH均呈负相关（P<0.05）,与CRP无相关性。5.与健康对照相比,PM/DM患者细胞因子INF-γ、IL-17A、TNF-α、IL-4、IL-10水平均升高（P<0.001）,IL-6有升高趋势,IL-2在两组间无差异。6.ANA阳性的PM/DM患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞和Th2细胞的绝对计数明显低于ANA阴性患者,差异有统计学意义（P<0.05）。在抗Jo-1抗体、抗Mi-2抗体及抗Ku抗体阳性组和阴性组患者间CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量无差异。7.65例接受肌肉MRI检查的PM/DM患者中,MRI结果异常57例,异常表现包括肌肉水肿、肌筋膜炎和脂肪浸润。较无脂肪浸润患者组而言,有脂肪浸润的患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞的绝对计数明显减少,Th17/Treg比值升高,均有统计学差异（P<0.05）。8.PM/DM患者在接受IL-2治疗的第1W和第12W分别与治疗前相比,ESR、CRP、CK、CKMB、LDH、HBDH明显降低（P<0.05）,在治疗的第1W和第12W,CD4+CD25+Foxp3+T细胞较治疗前持续增高,Th17/Treg比值则下降,均有统计学意义（P<0.05）。PM/DM患者在接受传统治疗的第12W与治疗前相比,ESR、CRP明显降低,肌酶无明显变化,Treg细胞降低,Th17/Treg比值增高。结论:1.PM/DM患者存在CD4+CD25+Foxp3+T细胞减少引起的Th17/Treg免疫失衡,这种免疫紊乱一定程度上参与了PM/DM的发病;2.CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM患者炎性指标及肌酶水平呈负相关,提示该细胞可作为病情评估的参考指标;3.PM/DM患者器官受累组CD4+CD25+Foxp3+T细胞明显低于无器官受累组,提示随着CD4+CD25+Foxp3+T细胞减少,PM/DM患者器官受累的风险可能增加;4.CD4+CD25+Foxp3+T细胞在有肌肉脂肪浸润的PM/DM患者明显低于无脂肪浸润患者,并且与患者病程呈负相关,提示该细胞的减少与肌肉慢性损伤可能相关,该细胞在PM/DM肌肉病变的评估中有一定价值;5.CD4+CD25+Foxp3+T细胞可作为PM/DM疗效评估的免疫指标之一,免疫调节治疗较免疫抑制剂而言,更适合于CD4+CD25+Foxp3+T细胞减少的患者。
沈志远[9]（2020）在《C-反应蛋白调控Th17细胞应答的机制研究》文中研究指明C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）是一种在进化中高度保守的典型人类急性期蛋白。早期的研究都认为CRP的功能主要是参与先天免疫应答。然而,近年来随着CRP与心血管疾病和自身免疫病的研究不断深入,人们发现CRP的功能不仅仅局限于先天免疫,在后天免疫应答中,CRP也能发挥重要的作用。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是一种由Th1和Th17细胞介导的自身免疫性疾病,是使用最广泛的人类多发性硬化（multiple sclerosis,MS）的动物模型。大量研究表明,CRP可以缓解EAE,但其相关病理机制尚不清楚。我们先前的研究发现,CRP可以通过与幼稚T细胞直接结合进而抑制Th1细胞应答,压制EAE的病情。然而,在CRP与T细胞的体外研究中我们并没有发现CRP对Th17的细胞应答的直接影响。但是,在CRP逆转EAE的能力被更多的研究证实后,其是否能够参与Th17的细胞应答就显得尤为重要。因此,我们就CRP对Th17细胞应答的综合影响展开了研究。首先,我们从EAE动物模型入手,通过检测CRP对EAE病发高峰期小鼠的脾细胞中各种Th细胞亚型的应答变化,发现CRP除了可以抑制Th1的应答外,还可以抑制小鼠体内Th17的细胞应答。结合我们之前的结论,CRP无法直接调控Th17的细胞应答,于是我们推测CRP对Th17的细胞应答调控是通过抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells,APC）间接介导发生的。为了验证这个假设,我们利用CD4+T细胞和全脾细胞分别与CRP共孵育的方式体外模拟CRP对Th17的直接和间接作用。结果发现CRP可以在APC的帮助下间接降低Th17细胞应答。为了检测CRP是通过哪种APC来介导其对Th17细胞应答的调控。我们分析了EAE小鼠中血液和CNS中的免疫细胞成分变化,发现在EAE病发时CNS区除了有T细胞的浸润外,还有大量的单核来源的树突状细胞（monocytes-derived dendritic cells,mo DCs）浸润。因此,我们分选了WT型小鼠的PBMCs并诱导其成为mo DCs,接着将其与分选的CD4+T细胞共孵育,发现CRP可以通过mo DCs压制Th17细胞应答,另外,由于CRP无法改变CNS中免疫细胞的浸润程度,所以我们推测CRP是通过改变mo DCs的抗原呈递能力来间接调控Th17细胞应答的。之后,我们通过q PCR筛选了CRP对mo DCs表面的抗原呈递能力相关分子的表达影响,然后在蛋白水平上进行验证。最终确认了CRP是通过抑制mo DCs上MHC-Ⅱ和CD86的表达来降低其抗原呈递能力的。与此同时,我们还借助CRP-/-小鼠验证了我们结论。由于FcγR2B是唯一报道的可介导CRP抑制EAE病情的受体,并且该受体在DCs上也表达,因此我们推测CRP有可能是通过FcγR2B受体发挥作用的。为此,我们使用FcγR2B/-小鼠进行了与在WT型小鼠中同样的实验,结果显示FcγR2B受体被敲除后,CRP对Th17的细胞应答的压制效果消失了,说明确实是FcγR2B受体介导了CRP对Th17的细胞应答。最后我们检测了与DCs的活化以及存活相关的NF-κB和ERK信号通路,发现在mo DCs活化的过程中,CRP可以显着的降低NF-κB和p-ERK1/2的表达。总之,通过本文的研究,我们得到结论:CRP可以通过FcγR2B受体作用于NF-κB和ERK信号通路,从而减弱mo DCs上MHC-Ⅱ和CD86的表达,降低mo DCs的抗原呈递能力,从而间接抑制Th17细胞应答。这种APC间接调节机制丰富了我们对CRP调节T细胞以及缓解EAE的理解,也为MS和其他T细胞介导的自身免疫性疾病的预防和治疗提供了新的思路和研究方向。
张凯[10]（2020）在《CD4+T细胞亚群在子宫内膜癌患者外周血、组织中的改变及各亚群之间相关性的探究》文中研究说明子宫内膜癌（endometrial cancer）是女性生殖系统中常见的三大恶性肿瘤之一,它的发生发展是一个涉及多因素、多阶段的复杂生物过程,其中80%为无孕激素拮抗的雌激素刺激内膜导致的I型EC,既往的研究发现肥胖、高血压、2型糖尿病和多囊卵巢综合征等代谢综合征（Metabolic syndrome,MS）均为子宫内膜癌发病的危险因素,然而,要充分了解肿瘤的生物学行为,还必须了解癌细胞所处的微环境,包括免疫细胞（T淋巴细胞、B细胞、NK细胞等）、细胞因子、成纤维细胞等复杂成分构成,其中CD4+T淋巴细胞介导的细胞免疫,在肿瘤免疫中具有重要作用。随着对肿瘤免疫微环境的深入研究,发现肿瘤微环境与多种恶性肿瘤的发生、转移有着密切的联系。目前,CD4+T细胞及其细胞亚群与子宫内膜癌的研究尚处于起步阶段,CD4+T细胞亚群之间通过细胞因子维持着动态的免疫平衡,一旦平衡被打破便会导致炎症、自身免疫性疾病和肿瘤的发生。然而,EC患者中CD4+T细胞亚群之间是否具有相互作用的关系,以及CD4+T细胞亚群是否能促进EC进展的机制仍未可知,因此,基于以上问题为出发点,本研究将分四部分初步探讨子宫内膜癌患者外周血和组织中CD4+T细胞亚群的表达及各亚群之间的相关性。方法:（1）收集351例子宫内膜癌患者的外周血的常规指标和临床病理特征,分析免疫炎性细胞指标与患者临床病理特征、预后的关系,并重点探讨F-NLR评分和F-PLR评分是否能作为预测EC患者预后的指标。（2）采用质谱流式方法、q RT-PCR方法从T细胞表面标记物层面和转录因子水平层面探究正常内膜对照组（NC组）、不典增生组（AH组）和子宫内膜癌组（EC组）三组外周血中CD4+T细胞亚群比例变化,并初步探究外周血CD4+T细胞各亚群比例之间的相关性。（3）采用质谱流式方法、q RT-PCR方法从T细胞表面标记物层面和转录因子水平层面探究正常内膜对照组（NC组）、不典增生组（AH组）和子宫内膜癌组（EC组）三组组织中CD4+T细胞亚群比例变化,并初步探究外周血CD4+T细胞各亚群比例之间的相关性。（4）体外提取CD4+T细胞,与子宫内膜癌细胞株体外构建Transwell共培养模型,观察CD4+T细胞对子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力的影响。结果:（1）高F-NLR得分与病理类型为II型、G3分级、III+IV期的子宫内膜癌患者关系更密切;高F-PLR得分与年龄≥60岁、绝经后状态、病理类型为II型、III+IV期和宫颈间质受累的EC患者关系更密切;对影响EC患者总体生存期和无瘤生存期的多因素分析提示:II型EC、FIGO分期为III+IV期、高F-NLR得分、高F-PLR得分是EC患者预后的独立危险因素。（2）EC组外周血中Th1细胞及T-bet m RNA表达水平较NC组明显降低,而Th2细胞及GATA3 m RNA表达水平明显升高;EC组外周血中Th17细胞及RORγt m RNA表达水平较NC组明显升高,Treg细胞及FOXP3 m RNA表达水平也明显升高;EC患者外周血中Th22细胞及AHR m RNA表达水平较NC组、AH组明显升高;各亚群之间相关性分析显示在EC组和AH组患者中Th1细胞表现出与Th2细胞具有正相关性,而在NC组中Th17细胞和Treg细胞之间呈现出正相关性。（3）EC组和AH组中局部组织浸润Th1细胞及T-bet m RNA表达水平要低于NC组;EC组中Th2细胞比例明显高于NC组,而GATA3 m RNA表达水平在AH组和EC组中逐渐递增;EC组中Th17细胞比例及RORγt m RNA表达水平、Treg细胞比例及FOXP3 m RNA表达水平和Th22细胞及AHR m RNA表达水平均要高于NC组;相关性结果显示EC组中Th1细胞与Th2细胞之间呈正相关性。（4）Transwell共培养实验表明体外CD4+T细胞对子宫内膜癌Ishikawa细胞和KLE细胞的侵袭能力有一定程度的影响。结论:1.子宫内膜癌初始治疗前外周血F-NLR和F-PLR评分更高的患者可能是总体生存期（OS）和无瘤生存期（PFS）潜在不良预后的独立危险因素,结合免疫炎性指标F-NLR和F-PLR的新型分级系统可作为EC的预后指标。2.EC患者外周血和组织中Th1细胞及主要转录因子T-bet m RNA表达水平较NC组要明显降低,Th2细胞及GATA3 m RNA转录因子表达水平、Th17细胞及RORγt m RNA转录因子表达水平、Treg细胞及FOXP3 m RNA转录因子表达水平、Th22细胞及AHR m RNA转录因子表达水平较NC组要明显升高,提示循环外周血和局部肿瘤微环境中Th1/Th2比例的失衡、Th17/Treg比例的失衡以及Th22细胞比例的异常可能都参与了EC患者疾病进展的过程。3.Transwell共培养模型发现,体外CD4+T细胞对子宫内膜癌Ishikawa细胞和KLE细胞的侵袭能力有一定程度的影响。
二、Th1/Th2细胞在炎症浸润中的不同表现（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Th1/Th2细胞在炎症浸润中的不同表现（论文提纲范文）
（1）基于转录组测序研究甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠的机制影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一: 自身免疫性甲状腺炎的中医药研究进展 |
| 1 自身免疫性甲状腺炎的中医概念 |
| 2 自身免疫性甲状腺炎的中医病因病机 |
| 3 自身免疫性甲状腺炎的辨证分型及分期分型 |
| 4 自身免疫性甲状腺炎的中医治疗 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 自身免疫性甲状腺炎的研究进展 |
| 1 发病诱因 |
| 2 发病机制 |
| 3 诊断与治疗 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三: STAT3/HIF1α通路在自身免疫性甲状腺炎中的研究进展 |
| 1 STAT3在免疫细胞中的作用 |
| 2 HIF1α在免疫细胞中的作用 |
| 3 STAT3/HIF1α通路在AIT中的作用 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一: LC/MS分析甲炎康泰成分并对其药效进行观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二: 转录组分析甲炎康泰对AIT大鼠甲状腺组织的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三: 甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠STAT3/HIF1α信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四: 甲炎康泰对Nthy-ori-3-1细胞STAT3/HIF1α信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
（2）旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶NBL-SP对炎症性肠病的干预作用及其机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 炎症性肠病的发病机制及治疗研究的最新进展 |
| 1.1 炎症性肠病的发病机制 |
| 1.2 炎症性肠病的治疗研究思路 |
| 1.3 用于炎症性肠病研究的疾病模型 |
| 2 蠕虫免疫调节功能在炎症性肠病中的作用 |
| 3 免疫细胞在“蠕虫疗法”中的生物学功能 |
| 3.1 树突状细胞 |
| 3.2 巨噬细胞 |
| 3.3 调节性B细胞 |
| 4.小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶NBL-SP的原核表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶NBL-SP对 TNBS诱导的小鼠炎症性肠病干预作用的探究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶NBL-SP通过树突状细胞在炎症性肠病中干预作用的机制探究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 在学期间成果 |
| 致谢 |
（3）调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 SLE与自身免疫反应 |
| 1.2.1 固有免疫系统在SLE中的作用 |
| 1.2.2 适应性免疫系统在SLE中的作用 |
| 1.3 Bregs研究进展 |
| 1.3.1 Bregs的定义及表型 |
| 1.3.2 Bregs的来源及发育 |
| 1.3.3 Bregs的生成调节 |
| 1.3.4 Bregs的功能 |
| 1.3.5 Bregs与自身免疫性疾病 |
| 1.3.6 Bregs与感染及肿瘤性疾病 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象、仪器和试剂 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血液样本采集 |
| 2.2.2 PBMC分离及培养 |
| 2.2.3 流式细胞仪检测B细胞、Th细胞亚群 |
| 2.2.4 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的细胞分子水平 |
| 2.2.5 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的BAFF浓度 |
| 2.2.6 CBA试剂盒检测Th细胞功能分子水平 |
| 2.2.7 Bregs亚群分选及培养 |
| 2.2.8 共培养系统的建立 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 研究对象的基本情况 |
| 3.2 SLE患者Bregs的表达情况 |
| 3.2.1 SLE患者外周血IL-10+/IL-35+/TGF-β1+Bregs亚群变化 |
| 3.2.2 SLE患者外周血不同表型Bregs的变化 |
| 3.2.3 SLE患者外周血IL-10、IL-35 以及TGF-β1水平 |
| 3.2.4 SLE患者外周血中Bregs功能变化的探索 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 SLE患者外周血Th细胞及B细胞亚群的表达情况 |
| 3.3.1 SLE患者外周血Th细胞亚群及其功能分子的变化 |
| 3.3.2 SLE患者外周血B细胞亚群的变化 |
| 3.3.3 SLE患者外周血BAFF水平的变化 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE临床指标的关系 |
| 3.5 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE器官受累的关系 |
| 3.6 免疫治疗后SLE患者外周血Bregs及及IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化 |
| 3.7 体外研究Bregs对SLE患者Th细胞亚群的影响 |
| 3.7.1 Transwell体系内Bregs对Th细胞的影响 |
| 3.7.2 小结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）MicroRNA-10b通过干扰CD4+T细胞亚型平衡促进关节炎的发展（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 类风湿关节炎病人滑膜组织样本 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 细胞 |
| 2.4 试剂和抗体 |
| 2.4.1 试剂 |
| 2.4.2 抗体 |
| 2.5 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 miR-10b在 RA患者中的表达情况 |
| 3.1.1 RT-qPCR检测miR-10b在RA患者PBMC中的表达情况 |
| 3.1.2 RT-qPCR检测miR-10b在RA患者滑膜组织中的表达情况 |
| 3.1.3 FISH检测miR-10b在RA患者滑膜组织中的表达情况 |
| 3.2 miR-10b基因敲除小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.1 鼠尾DNA提取 |
| 3.2.2 PCR扩增 |
| 3.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3 mi R-10b基因敲除对CAIA小鼠关节炎模型的影响 |
| 3.3.1 CAIA小鼠关节炎模型构建 |
| 3.3.2 CAIA小鼠关节炎模型整体指标评价 |
| 3.3.3 CAIA小鼠关节炎模型膝关节病理改变及评分 |
| 3.4 CAIA小鼠关节炎模型PBMC和滑膜组织RNA测序 |
| 3.5 MiR-10b对 CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.5.1 流式分选CD4~+T细胞 |
| 3.5.2 CD4~+T转染 |
| 3.5.3 流式检测miR-10b对CD4~+T细胞的作用 |
| 3.6 miR-10b靶基因预测及验证 |
| 3.6.1 生物信息学预测miR-10b的潜在靶点 |
| 3.6.2 双荧光素酶检测miR-10b与其靶点的直接结合作用 |
| 3.6.3 Western blot检测miR-10b对靶点的抑制作用 |
| 3.7 免疫组化检测GATA3和PTEN在类风湿关节炎患者滑膜组织中表达情况 |
| 3.8 MiR-10b靶基因GATA3及PTEN敲低对CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.8.1 siRNA最优序列的选取 |
| 3.8.2 GATA3和PTEN siRNA对CD4~+T亚群分化的影响 |
| 3.9 miR-10b抑制剂对小鼠CIA模型的治疗作用 |
| 3.9.1 建立小鼠CIA模型 |
| 3.9.2 小鼠CIA模型整体指标评价 |
| 3.9.3 膝关节病理变化检查 |
| 3.9.4 胸腺指数和脾脏指数检测 |
| 3.9.5 免疫组化检测小鼠CD4的表达 |
| 3.9.6 流式细胞术检测小鼠CD4~+T 细胞亚群比例变化 |
| 3.10 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 miR-10b在RA患者中表达情况 |
| 4.1.1 miR-10b在RA患者PBMC中表达情况 |
| 4.1.2 miR-10b在RA患者滑膜组织中表达情况 |
| 4.1.3 miR-10b在RA患者滑膜组织中的定位 |
| 4.2 miR-10b基因敲除对CAIA模型的影响 |
| 4.2.1 小鼠繁育及基因型鉴定 |
| 4.2.2 miR-10b基因敲除对CAIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数的影响 |
| 4.2.3 miR-10b基因敲除对CAIA小鼠膝关节病理的影响 |
| 4.3 miR-10b促进CAIA关节炎模型发生与发展的作用机制 |
| 4.3.1 CAIA关节炎模型组织RNA测序 |
| 4.3.2 异常表达基因的KEGG信号通路分析 |
| 4.3.3 CD4~+T细胞分选策略 |
| 4.3.4 CD4~+T细胞转染效率 |
| 4.3.5 miR-10b模拟物对CD4~+T细胞亚群分化的影响 |
| 4.3.6 miR-10b抑制剂对CD4~+T细胞亚群分化的影响 |
| 4.4 mi R-10b调节CD4~+T 细胞亚群分化的作用机制 |
| 4.4.1 miR-10b靶基因预测结果 |
| 4.4.2 MiR-10b与靶基因的直接结合作用 |
| 4.4.3 miR-10b对靶基因蛋白表达的影响 |
| 4.4.4 RA患者滑膜组织中GATA3和PTEN的表达情况 |
| 4.4.5 CAIA小鼠膝关节中GATA3和PTEN的表达情况 |
| 4.5 GATA3和PTEN siRNA对CD4~+T细胞亚群分化的影响 |
| 4.5.1 筛选GATA3 siRNA结果 |
| 4.5.2 筛选PTEN siRNA结果 |
| 4.5.3 GATA3 siRNA对Th1和Th2细胞分化的影响 |
| 4.5.4 PTEN siRNA对Th17和Treg细胞分化的影响 |
| 4.6 Mi R-10b抑制剂对小鼠CIA模型的治疗作用 |
| 4.6.1 建立DBA/1小鼠CIA模型 |
| 4.6.2 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠体重的影响 |
| 4.6.3 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠关节炎指数和关节炎肿胀数的影响 |
| 4.6.4 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠足爪厚度的影响 |
| 4.6.5 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节病理改变的影响 |
| 4.6.6 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠指关节和膝关节软骨破坏的影响 |
| 4.6.7 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠脾脏病理改变的影响 |
| 4.6.8 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 |
| 4.6.9 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节病理和血管化的影响 |
| 4.6.10 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节滑膜CD4表达的影响 |
| 4.6.11 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节滑膜GATA3和PTEN表达的影响 |
| 4.6.12 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠脾脏CD4表达的影响 |
| 4.6.13 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠PBMC中CD4~+T细胞亚群的影响 |
| 4.6.14 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠脾脏中CD4~+T细胞亚群的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 课题创新点 |
| 8 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:成纤维样滑膜细胞调节的滑膜炎在骨关节炎发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 预防性IL-27处理对哮喘模型小鼠气道炎症、气道高反应和气道重构的影响及相关的信号通路研究 |
| 一、材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要配制试剂极其配制方法 |
| 4. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 哮喘动物模型的建立 |
| 2. 气道反应性测定 |
| 3. 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 |
| 4. ELISA法测定BALF的上层清液和血清中细胞因子的含量 |
| 5. 实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)法检测肺组织中STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达 |
| 6. Wester blot检测肺组织中STAT1、 pSTAT1、 STAT3、 pSTAT3、 T-bet和GATA3蛋白的表达 |
| 7. 组织病理 |
| 8. 技术路线图 |
| (三) 统计学处理 |
| 二 结果 |
| 1. OVA诱导的哮喘模型小鼠症状及体征变化 |
| 2. 三组小鼠BALF中细胞总数和分类 |
| 2.1 IL-27降低小鼠BALF中细胞总数 |
| 2.2 IL-27降低小鼠BALF中不同的白细胞数量 |
| 3. IL-27改善小鼠的AHR |
| 4. IL-27减少急性哮喘模型三组小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、L-17含量,提高IFN-y含量 |
| 5. IL-27降低急性哮喘模型三组小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17含量,提高IFN-γ水平 |
| 6. IL-27提高小鼠肺组织STAT1、STAT3、T-bet mRNA的表达,减低GATA3 mRNA的表达 |
| 6.1 STAT1 mRNA PCR定量分析 |
| 6.2 STAT3 mRNA PCR定量分析 |
| 6.3 GATA3 mRNA PCR定量分析 |
| 6.4 T-bet mRNA PCR定量分析 |
| 7. IL-27提高小鼠肺组织STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3和T-bet蛋白的表达,降低GATA3的表达 |
| 7.1 STAT1和磷酸化STAT1(p-STAT1)蛋白的表达 |
| 7.2 STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达 |
| 7.3 GATA3蛋白的表达 |
| 7.4 T-bet蛋白的表达 |
| 8. IL-27改善慢性小鼠哮喘模型的气道重构 |
| 8.1 IL-27改善小鼠基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生程度 |
| 8.2 IL-27改善小鼠杯状细胞增生程度 |
| 8.3 IL-27减少小鼠上皮下纤维化程度 |
| 8.4 IL-27降低小鼠纤维母细胞的激活程度 |
| 8.5 IL-27改善小鼠血管生成状况 |
| 第二部分 治疗性IL-27处理对哮喘模型小鼠气道炎症、气道高反应和气道重构的影响 |
| 一、材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要配制试剂极其配制方法 |
| 4. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 哮喘动物模型的建立 |
| 2. 气道反应性测定 |
| 3. 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 |
| 4. ELISA法测定BALF的上层清液和血清中细胞因子的含量 |
| 5. 实时定量PCR法检测肺组织中STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达 |
| 6. Wester blot检测肺组织中STAT1、pSTAT1、STAT3、pSTAT3、T-bet和GATA3蛋白的表达 |
| 7. 组织病理 |
| 8. 技术路线图 |
| (三) 统计学处理 |
| 二、结果 |
| 1. 哮喘模型小鼠症状及体征变化 |
| 2. 三组小鼠BALF中细胞总数和分类 |
| 2.1 IL-27不能降低小鼠BALF中细胞总数 |
| 2.2 IL-27对小鼠BALF中不同类型的白细胞含量无影响 |
| 3. IL-27不能改善小鼠的AHR |
| 4. IL-27对急性哮喘模型小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量没有影响 |
| 5. IL-27不影响急性哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-y水平 |
| 6. IL-27不影响小鼠肺组织STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达. |
| 6.1 STAT1 mRNA PCR定量分析结果 |
| 6.2 STAT3 mRNA PCR定量分析结果 |
| 6.3 GATA3 mRNA的表达 |
| 6.4 T-bet mRNA PCR定量分析 |
| 7. IL-27对小鼠肺组织STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT1、T-bet和GATA3蛋白的表达没有作用 |
| 7.1 STAT1和p-STAT1蛋白的表达 |
| 7.2 STAT3和p-STAT3蛋白的表达 |
| 7.3 GATA3蛋白的表达 |
| 7.4 T-bet蛋白的表达 |
| 8. IL-27对慢性小鼠哮喘模型气道重构没有影响 |
| 8.1 IL-27不改善模型小鼠基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生 |
| 8.2 IL-27不影响模型小鼠杯状细胞增生状况 |
| 8.3 IL-27不能减少模型小鼠上皮下纤维化 |
| 8.4 IL-27不影响模型小鼠纤维母细胞的激活 |
| 8.5 IL-27不改善模型小鼠血管增生状况 |
| 讨论 |
| 1. 支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病 |
| 2. 预防性给予IL-27抑制OVA诱导的急性BA模型小鼠气道炎症和AHR |
| 3. 预防性给予IL-27可以改善OVA诱导的慢性哮喘模型小鼠气道重构 |
| 4. IL-27通过STAT1/STAT3信号途径改善OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症、AHR和气道重构 |
| 5. 治疗性给予IL-27不能改善OVA诱导的BA小鼠气道炎症、AHR以及气道重构 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素-27在T淋巴细胞免疫中的作用 |
| 1. IL-27的分子组成 |
| 2. IL-27的来源 |
| 3. IL-27的受体 |
| 4. IL-27的信号转导 |
| 5. IL-27在T细胞免疫中的作用 |
| 5.1 IL-27在Th1细胞免疫中的作用 |
| 5.2 IL-27在Th2细胞免疫中的作用 |
| 5.3 IL-27在Th17细胞免疫中的作用 |
| 5.4 IL-27在Treg免疫中的作用 |
| 5.5 IL-27在滤泡辅助T细胞(Tfh)免疫中的作用 |
| 5.6 IL-27在Th22细胞免疫中的作用 |
| 5.7 IL-27在Th9细胞免疫中的作用 |
| 5.8 IL-27在CD8~+T细胞免疫中的作用 |
| 6. 结语 |
| 7. 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 炎症性肠病 |
| 1.1.1 炎症性肠病流行病学 |
| 1.1.2 IBD的致病因素及病理学改变 |
| 1.1.3 IBD相关的发病机制 |
| 1.1.4 IBD的药物治疗 |
| 1.1.5 IBD的天然药物治疗 |
| 1.2 CD4~+T细胞与IBD |
| 1.2.1 Th1/Th2细胞平衡与IBD |
| 1.2.2 Th17/Treg细胞平衡与IBD |
| 1.3 DC与IBD |
| 1.3.1 DC的分类及功能 |
| 1.3.2 DC在IBD发病中的作用 |
| 1.3.3 DC回输治疗IBD |
| 1.4 桦褐孔菌及桦褐孔菌多糖 |
| 1.4.1 桦褐孔菌的生长环境及药用价值 |
| 1.4.2 桦褐孔菌多糖的生物活性 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 IOP的提取及对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 IOP的提取与高效液相色谱检测 |
| 2.3.2 DSS诱导慢性结肠炎模型的建立及DAI评估 |
| 2.3.3 结肠的组织学检测及评分 |
| 2.3.4 结肠组织中TJ蛋白及JAK-STAT信号通路蛋白的免疫组织化学检测 |
| 2.3.5 结肠组织中TJ蛋白及JAK-STAT信号通路蛋白的蛋白质免疫印迹检测 |
| 2.3.6 CD4~+T细胞相关细胞因子及转录因子的检测 |
| 2.3.7 小鼠脾脏及肠系膜淋巴结中CD4~+T细胞亚群的检测 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 IOP单糖组成分析 |
| 2.4.2 IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的病理进展的影响 |
| 2.4.3 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织损伤程度的影响 |
| 2.4.4 IOP对结肠组织中CD4~+T细胞亚群细胞因子及转录因子表达情况的影响 |
| 2.4.5 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1/Th2细胞平衡的影响 |
| 2.4.6 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th17/Treg细胞平衡的影响 |
| 2.4.7 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织中JAK-STAT信号通路的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IOP对CD4~+T细胞体外分化的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠脾脏中CD4~+T细胞的分离及活化 |
| 3.3.2 Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化 |
| 3.3.3 细胞上清液中细胞因子的检测 |
| 3.3.4 体外活化的CD4~+T细胞相关的细胞因子及转录因子的检测 |
| 3.3.5 CD4~+T细胞的活化、增殖、定向分化检测 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 IOP对CD4~+T细胞的活化及增殖过程的影响 |
| 3.4.2 IOP对抗鼠CD3ε和抗鼠CD28抗体活化的CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.4.3 IOP对抗鼠CD3ε和抗鼠CD28抗体活化的CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.4.4 IOP对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 IOP对BMDC成熟度及功能的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 BMDC的分离与培养 |
| 4.3.2 BMDC与CD4~+T细胞的MLR反应体系的建立 |
| 4.3.3 BMDC成熟度及CD4~+T细胞亚群分化情况的检测 |
| 4.3.4 细胞培养上清液中细胞因子检测 |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 IOP对炎症环境下BMDC的耐受状态的影响 |
| 4.4.2 IOP对BMDC_(LPS)细胞因子分泌的影响 |
| 4.4.3 IOP对MLR体系中Th1细胞分化的影响 |
| 4.4.4 IOP对MLR体系中Th17细胞的分化的影响 |
| 4.4.5 IOP对MLR体系中Treg细胞的分化的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IOP_L-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 BMDC回输治疗DSS诱导的急性结肠炎 |
| 5.3.2 结肠组织组织学检测及组织学评分 |
| 5.3.3 结肠组织中TJ蛋白的检测 |
| 5.3.4 急性结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4~+T细胞亚群群分化的检测 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 IOP_L-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用 |
| 5.4.2 IOP_L-BMDC对结肠组织中TJ蛋白表达量的影响 |
| 5.4.3 IOP_L-BMDC对脾脏中Th1细胞、Th17细胞分化的影响 |
| 5.4.4 IOP_L-BMDC对MLN中Th1细胞、Th17细胞分化的影响 |
| 5.4.5 IOP_L-BMDC对脾脏及MLN中Treg细胞分化的影响 |
| 5.4.6 IOP_L-BMDC对结肠组织中CD4~+T细胞相关细胞因子的分泌的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）CD4+CD25+Foxp3+T细胞在炎性肌病发病及疗效评估中的意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 CD4+CD25+Foxp3+T细胞在炎性肌病的表达 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 PM/DM患者外周血淋巴细胞亚群的表达 |
| 2.2 PM/DM患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达 |
| 2.3 PM/DM患者外周血淋巴细胞亚群的比值 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第二部分 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与炎性肌病临床特征的关系 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般临床资料 |
| 2.2 淋巴细胞亚群在PM/DM的性别分布 |
| 2.3 CD4+CD25+Foxp3+T细胞在PM/DM的性别分布 |
| 2.4 淋巴细胞亚群与PM/DM发病年龄及病程的关系 |
| 2.5 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM发病年龄及病程的关系 |
| 2.6 淋巴细胞亚群与PM/DM器官受累的关系 |
| 2.7 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM器官受累的关系 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三部分 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与炎性肌病血清学和免疫学指标的关系 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 PM/DM患者血清学指标 |
| 2.2 PM/DM患者外周血细胞因子和自身抗体的表达 |
| 2.3 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM患者血清学指标的关系 |
| 2.4 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM患者细胞因子的关系 |
| 2.5 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与PM/DM患者自身抗体的关系 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第四部分 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与炎性肌病影像学表现的关系 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 PM/DM患者肌肉MRI表现 |
| 2.2 PM/DM患者肌肉MRI表现与血清学指标的关系 |
| 2.3 淋巴细胞亚群与肌肉MRI表现间的关系 |
| 2.4 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与肌肉MRI表现间的关系 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第五部分 CD4+CD25+Foxp3+T细胞在炎性肌病疗效评估中的作用 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 PM/DM患者治疗前后血清学指标的变化 |
| 2.2 PM/DM患者治疗前后淋巴细胞亚群的变化 |
| 2.3 PM/DM患者治疗前后CD4+CD25+Foxp3+T细胞的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）C-反应蛋白调控Th17细胞应答的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1. C-反应蛋白概述 |
| 1.1.1 CRP的结构 |
| 1.1.2 CRP的常见配体与受体 |
| 1.1.3 CRP的合成与表达调控 |
| 1.1.4 CRP的构象变化 |
| 1.1.5 CRP与炎症 |
| 1.1.6 CRP与心血管疾病 |
| 1.1.7 CRP与自身免疫病 |
| 1.2 Th细胞的分化 |
| 1.2.1 Th1细胞 |
| 1.2.2 Th2细胞 |
| 1.2.3 Th17细胞 |
| 1.2.4 Treg细胞 |
| 1.2.5 Th各亚型关系 |
| 1.3 实验性自身免疫性脑脊髓炎 |
| 1.4 课题研究的目的及意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1. 实验材料 |
| 2.1.1. 实验动物 |
| 2.1.2. 实验主要试剂 |
| 2.1.3. 实验仪器 |
| 2.2. 实验方法 |
| 2.2.1. CRP-/-小鼠品系的建立 |
| 2.2.2. CRP蛋白的纯化制备 |
| 2.2.3. EAE小鼠模型的建立 |
| 2.2.4. 小鼠脾脏细胞和脾脏CD4~+T细胞的分选和培养 |
| 2.2.5. Th1/Th17的体外分化实验 |
| 2.2.6. 外周血和中枢神经系统中免疫细胞的分离 |
| 2.2.7. moDCs的诱导、培养及处理 |
| 2.2.8. Real time PCR |
| 2.2.9. ELISA实验 |
| 2.2.10. Western Blot |
| 2.2.11. 流式实验 |
| 2.2.12. 组织切片染色 |
| 第三章 实验结论与分析 |
| 3.1. CRP可以抑制小鼠EAE中 Th17 的细胞应答 |
| 3.1.1. CRP可以缓解EAE病情 |
| 3.1.1.1. 小鼠临床病情分析 |
| 3.1.1.2. EAE模型的常规组织病理学变化 |
| 3.1.2. CRP可以抑制MOG诱导的EAE中的Th17和Th1 应答 |
| 3.2. CRP通过间接作用调节脾细胞中的Th17的细胞应答 |
| 3.2.1 CRP对 Th17 细胞和Th1 细胞应答的影响 |
| 3.2.2 CRP对 Th17 细胞和Th1 细胞分化的影响 |
| 3.3. moDCs介导CRP对 Th17 的细胞应答 |
| 3.3.1. 小鼠EAE病发高峰期血液中免疫细胞的成分变化 |
| 3.3.2. 小鼠EAE病发高峰期CNS中免疫细胞的成分变化 |
| 3.3.3. EAE小鼠病发高峰期CNS区免疫浸润单核细胞的鉴定 |
| 3.3.4. CRP通过moDCs压制Th17 的细胞应答 |
| 3.4. CRP通过减弱moDCs的抗原呈递能力来调节Th17 的细胞应答 |
| 3.4.1 CRP可以抑制moDCs上 MHC-II和 CD86 的表达 |
| 3.4.2 CRP-/-小鼠验证CRP对 DCs抗原呈递能力的抑制 |
| 3.5. moDCs上的FcγR2B介导CRP对 Th17 细胞应答的调节 |
| 3.5.1. CRP可以改善FcγR2B-/-小鼠的EAE病情 |
| 3.5.2. CRP对 FcγR2B-/-小鼠EAE模型中T细胞的应答影响 |
| 3.5.3. 体外实验中FcγR2B对 CRP调控Th17和Th1 应答的影响 |
| 3.5.4. CRP通过moDCs上的FcγR2B来压制Th17和Th1 的细胞应答 |
| 3.5.5. FcγR2B受体介导CRP对 moDCs抗原呈递能力的调控 |
| 3.6. CRP通过NF-κB和 ERK信号通路调控moDCs的抗原呈递能力 |
| 3.6.1. CRP对 WT型小鼠的moDCs中 NF-κB和 p-ERK1/2 信号分子的表达影响 |
| 3.6.2. CRP-/-小鼠的moDCs中 NF-κB和 p-ERK1/2 信号分子的表达情况 |
| 3.6.3. CRP对 FcγR2B-/-小鼠的moDCs中 NF-κB和 p-ERK1/2 的表达影响 |
| 第四章 结果与讨论 |
| 4.1. 主要实验结果 |
| 4.2. 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 所有题录的数据正常在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）CD4+T细胞亚群在子宫内膜癌患者外周血、组织中的改变及各亚群之间相关性的探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、外周血免疫炎症相关指标F-NLR/F-PLR与子宫内膜癌临床病理特征的相关性分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 子宫内膜癌病人临床数据收集 |
| 1.1.2 临界值的确定 |
| 1.1.3 F-NLR和 F-PLR的评估和分类 |
| 1.1.4 随访 |
| 1.1.5 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 病人一般临床特征 |
| 1.2.2 EC患者免疫炎症指标参数与临床病理特征的相关性分析 |
| 1.2.3 EC患者F-NLR和 F-PLR评分与临床病理因素的相关性分析 |
| 1.2.4 影响EC患者预后的单因素分析 |
| 1.2.5 影响EC患者预后的多因素分析 |
| 1.2.6 随访结局 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 免疫炎性细胞与肿瘤的关系 |
| 1.3.2 血浆纤维蛋白原与肿瘤的关系 |
| 1.3.3 F-NLR评分、F-PLR评分与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.4 本研究的局限性 |
| 1.4 小结 |
| 二、子宫内膜癌患者外周血中CD4~+T细胞亚群比例变化及各亚群之间相关性的初步探究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 临床病例资料的收集 |
| 2.1.3 三组外周血单核细胞(PBMCs)的收集和储存 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.1.7 实验结果统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 研究对象的一般临床病理特征 |
| 2.2.2 非肿瘤对照组、不典型增生组、EC组外周血中CD4~+T细胞亚群数量和比例变化 |
| 2.2.3 三组外周血中CD4~+T细胞各亚群功能分子mRNA的表达水平 |
| 2.2.4 非肿瘤对照组、不典型增生组、EC组外周血中CD4~+T细胞亚群之间相关性的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 Th1/Th2 细胞与EC的关系 |
| 2.3.2 Th17/Threg 细胞与 EC 的关系 |
| 2.4 小结 |
| 三、子宫内膜癌患者组织中CD4~+T细胞亚群比例变化及各亚群之间相关性的初步探究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 实验结果统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 三组组织单个核细胞中CD4~+T细胞亚群的比例 |
| 3.2.2 EC病人组织单个核细胞中CD4~+T细胞亚群比例相关性分析 |
| 3.2.3 三组组织中CD4~+T细胞各亚群功能分子mRNA的表达水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 肿瘤局部免疫微环境与外周血之间的交互(corsstalk)作用 |
| 3.3.2 肿瘤免疫治疗 |
| 3.4 小结 |
| 四、CD4~+T细胞对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭能力的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.1.6 统计方法处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Ficoll分层-磁珠分离提取活化CD4~+T细胞 |
| 4.2.2 CD4~+T 细胞对子宫内膜癌细胞的迁移实验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 CD4~+T细胞及亚群的分化调节特点 |
| 4.3.2 CD4~+T细胞与肿瘤的关系 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 CD4~+T细胞亚群在子宫内膜癌中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章及成果 |
四、Th1/Th2细胞在炎症浸润中的不同表现（论文参考文献）
- [1]基于转录组测序研究甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠的机制影响[D]. 张程斐. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]旋毛虫重组丝氨酸蛋白酶NBL-SP对炎症性肠病的干预作用及其机制探究[D]. 渠铮. 吉林大学, 2021
- [3]调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究[D]. 叶壮. 吉林大学, 2021(01)
- [4]MicroRNA-10b通过干扰CD4+T细胞亚型平衡促进关节炎的发展[D]. 韩大飞. 安徽医科大学, 2021(01)
- [5]白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用[D]. 鲁德玕. 山东大学, 2020(04)
- [6]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)
- [7]桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究[D]. 陈一方. 延边大学, 2020(05)
- [8]CD4+CD25+Foxp3+T细胞在炎性肌病发病及疗效评估中的意义[D]. 闫成兰. 山西医科大学, 2020(12)
- [9]C-反应蛋白调控Th17细胞应答的机制研究[D]. 沈志远. 兰州大学, 2020(04)
- [10]CD4+T细胞亚群在子宫内膜癌患者外周血、组织中的改变及各亚群之间相关性的探究[D]. 张凯. 天津医科大学, 2020(06)