自噬在白血病K562/ADM细胞多药耐药性及三氧化二砷抗白血病效应中的作用

论文摘要

目的：白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病,近几十年中,得益于化疗药物的联合应用及骨髓移植治疗技术的进展,使其治疗取得了长足的发展,但化学治疗药物诱发产生的白血病细胞多药耐药性（multi-drug resistance, MDR）是影响临床白血病治疗效果的主要障碍,也是影响白血病骨髓移植有效性和成功率的重要因素,目前仍对白血病耐药性缺乏有效而实用的干预措施。研究证实细胞自噬（autophagy）与肿瘤／白血病的发生、发展、预后和治疗效果的关系密切,但细胞自噬活性与肿瘤／白血病对治疗药物的敏感性及耐药性发生的关系尚不清楚。我们选用白血病多药耐药细胞株K562/ADM细胞及其亲本细胞株K562细胞为研究细胞模型,采用营养剥夺（饥饿）的方法诱导白血病细胞发生自噬,比较研究白血病耐药性细胞和敏感细胞的自噬活性的差异以及抑制自噬活性对耐药细胞药物敏感性的影响,探讨细胞自噬活性在白血病细胞多药耐药性中的作用及其调控机制。同时,三氧化二砷因与常规化疗药物无交叉耐受性而应用于临床耐药性白血病的治疗,研究三氧化二砷是否通过细胞自噬途径发挥抗耐药性白血病的作用,对于阐明三氧化二砷治疗耐药性白血病的机制有重要应用价值。方法：对数生长期的白血病细胞株K562和K562/ADM细胞,以无血清和无氨基酸的磷酸缓冲液（phosphate buffered solution, PB S）代替RPIM-1640+小牛血清培养液培养细胞,培养Oh、3h、6h、9h、12h后收集细胞,透射电镜观察自噬体形态,MDC（单丹磺酰戊二胺）荧光染色、荧光显微镜和流式细胞仪检测自噬体荧光染色；实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein-1light chain3, LC3） LC3和自噬相关基因Beclin-1mRNA表达, Western Blotting检测LC3和Beclin-1蛋白的表达以及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。同时,采用RT-qPCR法和流式细胞术分别检测细胞自噬过程中多药耐药基因1（mdrl）/P-糖蛋白（P-gp）表达的动态变化。不同浓度阿霉素单独或联合自噬抑制剂3-MA（5mmol/L）作用K562/ADM细胞24h-72h, MIT测定K562/ADM细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染、流式细胞术测定K562/ADM细胞的凋亡。透射电镜观察自噬体形态,Western Blotting法检测LC3的表达及LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的转化。不同浓度三氧化二砷作用K562细胞及K562/ADM细胞不同时间后,透射电镜观察自噬体形态,倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测自噬体MDC染色；RT-qPCR法检测Benlin-1与Bcl-2的mRNA表达,Western Blotting分析检测Beclin-1、Bcl-2和LC3蛋白表达以及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。不同浓度三氧化二砷单独或联合自噬抑制剂3-MA （5mmol/L）作用K562和K562/ADM细胞24-48h,MTT测定细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染、流式细胞术测定细胞的凋亡。结果：1.与K562细胞相比,K562/ADM耐药细胞具有较高的基础自噬活性；饥饿法诱导K562与K562/ADM细胞发生自噬,在诱导的早期（3h） K562/ADM耐药细胞的自噬活性即迅速增高,而敏感的K562细胞的自噬活性发生较晚（9h）,提示耐药白血病细胞早期而快速发生的自噬活性更有利于应对外界环境改变、保持细胞稳定性；自噬相关基因Beclin-1参与自噬的调节,K562/ADM细胞的表达高于K562细胞,与自噬活性的变化一致。有趣的是,K562/ADM细胞的mdrl/P-gp的表达随细胞自噬活性增强而表达增高,3-MA抑制自噬活性其表达相应降低。提示P-gp可能参与耐药性白血病细胞自噬活性的调控。2.K562/ADM细胞对阿霉素诱导的凋亡效应有很强的抵抗性。10μmol/L的阿霉素处理K562/ADM细胞48h,电镜下可见明显的自噬形态改变, Western Blotting检测可见LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增强,说明阿霉素处理可诱导K562/ADM耐药细胞发生较强的自噬。若用3-MA处理可显著减低K562/ADM细胞的自噬活性,阿霉素诱导的K562/ADM细胞的凋亡显著增高、存活细胞率明显减少。提示抑制细胞自噬活性可提高K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性、降低其耐药性。3.K562细胞和K562/ADM细胞均对三氧化二砷具有较高的敏感性,在不同浓度三氧化二砷诱导K562细胞和K562/ADM细胞增殖抑制和凋亡过程中,两种细胞均发生显著的自噬活性改变,自噬活性差异并不明显,但K562/ADM细胞自噬的出现较K562细胞为早。同时,三氧化二砷可增高K562和K562/ADM细胞Beclin-1基因mRNA及蛋白的表达,而显著降低Bcl-2基因mRNA及蛋白的表达,Beclin-1可能通过与Bcl-2的相互作用参与三氧化二砷诱导白血病细胞凋亡和自噬过程。3-MA抑制细胞自噬活性,可提高三氧化二砷诱导的K562细胞和K562/ADM细胞的死亡率,但增高的程度均并不十分显著。综合分析结果提示三氧化二砷在K562细胞和K562/ADM细胞中诱发的自噬活性,早期主要为应激性的保护反应,但随三氧化二砷作用时间的延长和诱导凋亡作用的增强,K562/ADM耐药细胞的自噬活性反而有所降低,提示三氧化二砷主要诱导耐药性白血病细胞发生细胞凋亡而非自噬性死亡,细胞自噬可能参与三氧化二砷的抗白血病机制但非主要因素。结论：1.白血病K562/ADM耐药细胞较其亲本K562敏感细胞具有更高的基础自噬活性,营养剥夺可引发白血病耐药性细胞发生早期而快速的自噬活性增强。Beclin-1参与自噬的调节,抑制细胞自噬活性可明显增高K562/ADM耐药细胞对阿霉素的敏感性、降低药物抵抗性,证明细胞自噬是参与白血病K562/ADM细胞多药耐药性形成的机制之一。2.营养剥夺诱导K562/ADM耐药细胞发生自噬过程中mdr1/P-gp的表达随细胞自噬活性增强而表达增高,细胞自噬活性被自噬抑制剂3-MA抑制其表达相应降低。mdr1/P-gp的表达变化与耐药细胞自噬活性的变化高度一致,提示P-gp可能参与耐药性白血病细胞自噬活性的调控,具体机制有待进一步探讨。3.三氧化二砷可诱发K562细胞和K562/ADM细胞发生自噬反应,Beclin-1及Bcl-2参与了其自噬形成机制,但随三氧化二砷作用时间的延长和诱导凋亡作用的增强,耐药细胞的自噬活性反而有所降低,抑制自噬活性白血病细胞对三氧化二砷的敏感性有所增强但不显著。提示三氧化二砷在耐药性白血病中诱发的早期自噬活性主要为应激性的保护反应,三氧化二砷主要诱导白血病细胞发生细胞凋亡而非自噬性死亡,细胞自噬可能参与三氧化二砷的抗白血病机制但非主要因素。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 第一章 自噬的研究进展
• 1 自噬的生理功能及其与疾病的关系
• 2 自噬与肿瘤的关系
• 第二章 三氧化二砷抗肿瘤的机制研究进展
• 1 三氧化二砷抗肿瘤作用的机制
• 2 三氧化二砷与肿瘤多药耐药
• 3 三氧化二碑与细胞自睡
• 参考文献
• 第二部分 研究论文
• 第一章 K562/ADM细胞自噬活性与药物敏感性的关系研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 2O₃抗白血病效应中的作用'>第二章 细胞自噬在AS₂O₃抗白血病效应中的作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 縮略词表
• 致谢