棉花叶片衰老及氮素再利用相关基因的克隆和分析

论文摘要

为了揭示棉花叶片衰老和衰老叶片中氮素再利用的生化过程,并阐明其分子机制,本试验以陆地棉品种山农丰抗6号为材料,利用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）构建了陆地棉子叶衰老过程中差异表达的cDNA文库,通过随机测序,获得了416条高质量的可读EST序列。对这些可读序列进行聚类分析,结果表明他们共代表216个不同的衰老相关基因。将这216条EST序列与GenBank数据库中的已知基因进行BLASTX比对（BLAST Against NR）,有151条EST序列与已知功能的基因同源,将这151条EST提交到GenBank的dbEST数据库,获得序列号为DV437859-DV438009。剩余的65条EST中有34条与已知基因没有同源性,划分为未知基因;另外31条与已知序列虽有一定的同源性,但比对得分值较低,因而也划分为未知基因。未知基因可能为棉花叶片衰老相关的新基因。依据拟南芥蛋白质组的功能分类标准,我们对来源于已知基因的151条EST序列进行分类,结果表明,棉花衰老子叶中存在12类基因:分别为大分子物质的代谢、能量、转录、蛋白质合成、蛋白质折叠与修饰、胞间转运、细胞信号转导、病害与防御、与环境的互作、细胞生长与增殖、细胞组分的合成和未明确功能的基因。除了未知功能的基因外,最主要的两类是大分子物质的代谢相关基因和细胞病害与防御相关基因。根据本研究分离的细胞蛋白质降解相关基因,推测棉花子叶衰老过程中存在三条蛋白质降解途径:泛素降解途径、液泡吞噬降解途径和叶绿体降解途径;棉花子叶衰老过程中存在三条氮素再利用途径:GS1/GOGAT循环、GDH/GOGAT循环和AspAT/AS循环。利用Northern杂交检测蛋白质降解和氮素再利用相关基因的表达,杂交结果表明,子叶发育的全过程都在发生蛋白质的泛素降解。但是子叶发育初期,蛋白质的泛素降解较弱,随着子叶的发育和衰老,该途径迅速增强,衰老后期,该途径又出现减弱趋势。与泛素降解途径不同,液泡吞噬降解途径在子叶发育初期并不表达,直到衰老中后期该途径才开始大量表达。GS1和NADH-GOGAT在棉花子叶衰老过程中大量表达,说明GS1/GOGAT循环是衰老子叶中氮素再利用的主要途径。GDH活性较小,而且在子叶衰老过程中表达量增幅较小,暗示GDH/GOGAT循环可能是氮素再利用的辅助途径。同样,衰老子叶中AspAT和AS的大量表达暗示这两个基因也是氮素再利用过程中的关键基因,因此我们推测AspAT/AS循环也是棉花子叶衰老过程中氮素再利用的主要途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物叶片衰老相关基因的研究
• 1.1.1 衰老相关基因的分离
• 1.1.2 衰老相关基因的分类
• 1.2 植物叶片衰老过程中的蛋白质降解途径
• 1.2.1 泛素降解途径
• 1.2.1.1 泛素降解途径的物质基础及机制
• 1.2.1.2 植物叶片衰老过程中的泛素降解途径
• 1.2.2 液泡吞噬降解途径
• 1.2.2.1 蛋白质的液泡吞噬降解途径机制
• 1.2.2.2 植物叶片衰老过程中的液泡吞噬降解途径
• 1.2.3 叶绿体降解途径
• 1.3 植物叶片衰老过程中氮素再利用的途径
• 1.3.1 GS/GOGAT 途径
• 1.3.2 PPDK- GS/GOGAT 途径
• 1.4 抑制消减杂交 （SSH） 在植物上的应用
• 1.4.1 不同发育阶段的差异表达基因
• 1.4.2 外界因素引起的植物基因差异表达
• 1.5 本研究的目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 酶及生化试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 叶绿素含量测定和子叶发育时期划分
• 2.2.2 子叶总RNA 提取
• 2.2.3 抑制消减杂交文库的构建
• 2.2.4 EST 序列的获得
• 2.2.5 序列同源性比较及功能分析
• 2.2.6 Northern 杂交
• 2.2.6.1 RNA 甲醛琼脂糖凝胶变性电泳
• 2.2.6.2 转膜
• 2.2.6.3 标记探针
• 2.2.6.4 杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 叶绿素含量测定及子叶发育时期划分
• 3.2 RNA 提取
• 3.3 EST 序列信息
• 3.3.1 EST 序列的获得及序列同源性比较
• 3.3.2 序列提交及功能分类
• 3.4 蛋白质降解相关基因表达分析
• 3.4.1 泛素降解途径
• 3.4.2 液泡降解途径
• 3.4.3 叶绿体降解途径
• 3.5 衰老子叶氮再利用相关基因表达分析
• 4 讨论
• 4.1 棉花子叶衰老相关基因的功能分析
• 4.2 棉花衰老子叶中蛋白质的降解
• 4.2.1 泛素降解途径
• 4.2.2 液泡吞噬降解途径
• 4.2.3 叶绿体降解途径
• 4.3 棉花衰老子叶中的氮素再利用途径
• 4.4 研究棉花子叶衰老过程中氮素再利用的意义
• 5 结论
• 5.1 叶绿素含量测定及子叶发育时期划分
• 5.2 棉花衰老子叶的抑制差减文库的构建
• 5.3 151 个已知基因 EST 的功能预测
• 5.4 棉花子叶衰老特有的蛋白质降解途径
• 5.5 棉花子叶衰老特有的氮素再利用途径
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况