拟南芥AT14A蛋白的细胞学定位及在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连续体中的功能研究

论文摘要

植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的研究目前还处于起步阶段,特别是质膜上的联结分子特性与功能还未形成定论。在动物细胞质膜上存在一类整合素蛋白（integrin）,它是一类胞外基质受体,介导细胞间的粘附作用和细胞内外的信号转导,并且参与调节多种细胞功能,如细胞分化、细胞与细胞间的相互作用、细胞对外界环境应答等。在植物细胞中是否也存在类似于动物细胞中的整合素蛋白分子目前尚无直接的实验证据。AT14A蛋白氨基酸序列中有一段与动物整合素蛋白同源,然而,目前还不清楚该蛋白是否就是植物细胞中的整合素蛋白（称为类整合素, integrin-like proteins）?如是,其功能又是如何?针对上述科学问题,本研究首先从拟南芥基因组中克隆了编码AT14A的基因序列,构建了相应突变体和过表达转基因悬浮培养细胞系,最后研究了该蛋白在介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中的功能。取得的主要结果如下:1、采用RT-PCR和TOPO克隆的方法从拟南芥中克隆出了AT14A,并与含GFP报告基因的表达载体连接,得到AT14A-GFP融合基因,通过农杆菌介导的方法转化野生型植株及悬浮细胞,获得了相应的转基因植株和悬浮细胞体系。通过观察GFP的荧光,确定AT14A在组织和细胞水平的定位。同时,完整植物材料体系的建立为研究AT14A的功能奠定了基础。2、利用蛋白质免疫印迹技术,以GFP抗体作为探针,在过表达转AT14A-GFP融合基因的悬浮细胞总蛋白与膜蛋白中均检测到了AT14A-GFP融合蛋白的存在,其分子量在70 kDa左右。且通过免疫印迹方法,在膜蛋白中也检测到了AT14A-GFP融合蛋白的存在,证实AT14A定位在质膜上。3、通过光学显微镜观察细胞的形态,发现缺失型突变体at14a悬浮细胞的形态发生明显变化,即60%以上变成球形。利用荧光定位技术,结合激光共聚焦显微镜的观察,发现野生型、缺失型突变体at14a、过表达转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的细胞骨架的结构与排列存在差异:缺失型突变体at14a悬浮细胞的微丝束变粗,且排列变得稀疏,而过表达转AT14A-GFP融合基因的悬浮细胞的微丝排列较野生型密集;缺失型突变体at14a细胞的微管排列杂乱而无规则,但过表达转AT14A-GFP融合基因细胞的微管形态与排列与野生型无明显区别。4、对悬浮细胞的细胞团大小的观察及统计的结果表明,野生型悬浮细胞57%的细胞团包含2-10个细胞,40%的细胞团包含10个以上细胞;缺失型突变体at14a悬浮细胞42%以单个游离的形式存在,且低于10%的细胞团包含10个以上细胞;而过表达转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的细胞团有74%包含10个以上细胞。此结果说明,AT14A参与了细胞与细胞之间的粘附。对三种基因型的悬浮细胞进行渗透胁迫处理的结果表明野生型细胞有90%以上发生部分质壁分离,约6%发生完全分离;而缺失型突变体at14a细胞均发生了质壁分离,并且其中62%发生了完全质壁分离;过表达转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的分离情况与野生型无明显差异。通过测定三种基因型植株离体叶片失水速率的测定结果表明缺失型突变体at14a离体叶片的失水速率最大,野生型次之,过表达植株的离体叶片的失水速率最小。以上结果提示:AT14A作为细胞壁（CW）-质膜（PM）-细胞骨架（CTK）连续体的重要联结分子,由于AT14A的缺失,导致细胞壁与质膜的粘附性降低,所以,在同样的胁迫条件下,缺失型突变体at14a悬浮细胞完全质壁分离的情况最为明显。并且,AT14A参与了细胞对渗透胁迫的响应过程,缺失型突变体由于AT14A功能的缺失,因而失去了对于渗透胁迫的响应能力。综合以上结果表明,AT14A是拟南芥细胞壁—质膜—细胞骨架连续体的中间成员,并与细胞骨架、细胞形态的改变之间存在密切关系,它还介导了细胞间的粘附作用,参与了拟南芥响应渗透胁迫的信号转导过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文对照词
• 第1章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 整合素
• 1.2.1 整合素的结构与功能
• 1.2.2 整合素的作用机理
• 1.2.3 整合素介导的信号转导途径
• 1.3 植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的组分结构与功能
• 1.3.1 植物类整合素的研究
• 1.3.1.1 植物类整合素蛋白的研究进展
• 1.3.1.2 植物类整合素的定位
• 1.3.1.3 植物类整合素蛋白的功能
• 1.3.1.4 植物类整合素蛋白研究展望
• 1.3.1.5 拟南芥AT14A的研究现状
• 1.3.2 细胞骨架的结构与功能
• 1.3.2.1 微管的结构
• 1.3.2.2 微管的功能
• 1.3.2.3 微丝的结构
• 1.3.2.4 微丝的功能
• 1.4 结语
• 第2章 AT14A 缺失型突变体和过表达转基因悬浮细胞系及植株体系的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 植物材料
• 2.2.1.2 质粒与菌株
• 2.2.1.3 试剂（盒）
• 2.2.1.4 培养基与主要试剂
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 过表达转AT14A基因植株与悬浮细胞体系的建立
• 2.2.2.1.1 拟南芥编码AT14A基因的TOPO克隆
• 2.2.2.1.1.1 引物的设计
• 2.2.2.1.1.2 拟南芥叶片总RNA的提取
• 2.2.2.1.1.3 第一链cDNA的合成
• 2.2.2.1.1.4 AT14A 序列的PCR 扩增
• 2.2.2.1.1.5 PCR 产物的回收
• 2.2.2.1.1.6 目的片段与克隆载体的连接
• 2.2.2.1.1.7 重组质粒的转化
• 2.2.2.1.1.8 阳性克隆的PCR 鉴定
• 2.2.2.1.2 转AT14A-GFP融合基因的双元载体的构建
• 2.2.2.1.2.1 重组质粒与表达载体质粒的小量提取
• 2.2.2.1.2.2 AT14A-GFP 融合基因的双元载体的构建与转化
• 2.2.2.1.2.3 农杆菌阳性克隆的目的基因序列的PCR 鉴定
• 2.2.2.1.2.4 农杆菌阳性克隆的 GFP 基因序列的 PCR 鉴定
• 2.2.2.1.3 根癌农杆菌介导法培育转基因拟南芥植株
• 2.2.2.1.3.1 野生型拟南芥植株的培育
• 2.2.2.1.3.2 根癌农杆菌的培养及其介导的拟南芥转化
• 2.2.2.1.3.3 T1代转AT14A-GFP融合基因拟南芥种子的抗性筛选
• 2.2.2.1.3.4 转AT14A-GFP融合基因拟南芥植株中总DNA的目的片段与 GFP的PCR鉴定
• 2.2.2.1.4 根癌农杆菌介导法培育转基因拟南芥悬浮细胞
• 2.2.2.1.4.1 转AT14A-GFP基因拟南芥悬浮细胞体系的培育
• 2.2.2.1.4.2 转AT14A-GFP融合基因拟南芥悬浮细胞中中总DNA的目的片段与GFP的PCR鉴定
• 2.2.2.2 缺失型突变体at14a悬浮细胞鉴定与培育
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 拟南芥叶片总RNA 的提取
• 2.3.2 拟南芥叶片第一链cDNA 的合成
• 2.3.3 拟南芥AT14A 序列TOPO 克隆的PCR 扩增
• 2.3.4 转AT14A-GFP融合基因的双元载体的DH5α阳性克隆的PCR鉴定
• 2.3.5 转AT14A-GFP融合基因的双元载体的农杆菌阳性克隆的PCR鉴定
• 2.3.6 转AT14A-GFP融合基因植株的获得与鉴定
• 2.3.6.1 转AT14A-GFP 融合基因植株的抗性筛选
• 2.3.6.2 转AT14A-GFP 融合基因植株的PCR 鉴定
• 2.3.7 转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的获得与鉴定
• 2.3.7.1 转AT14A-GFP 融合基因愈伤的筛选
• 2.3.7.2 转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的PCR鉴定
• 2.3.8 缺失型突变体at14a悬浮细胞的获得与鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 AT14A 的鉴定及定位
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 细胞总蛋白的提取
• 3.2.2.2 细胞膜蛋白的提取
• 3.2.2.3 蛋白质浓度测定及SDS-PAGE
• 3.2.2.4 Western blot
• 3.2.2.5 显微镜观察
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 拟南芥悬浮细胞中AT14A-GFP 融合蛋白的免疫印迹
• 3.3.2 AT14A-GFP 融合基因GFP 表达的细胞与组织学定位
• 第四章 AT14A 功能的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 细胞形态的观察
• 4.2.2.2 细胞骨架蛋白（微管和微丝蛋白）的荧光定位
• 4.2.2.3 细胞团大小的比较
• 4.2.2.4 细胞质壁分离情况的比较
• 4.2.2.5 离体叶片失水速率（RWL，Rates of water loss）的测定
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 不同基因型悬浮培养细胞的形态差异比较
• 4.3.2 AT14A 蛋白对细胞骨架排列的影响
• 4.3.3 不同基因型悬浮培养细胞间黏附差异比较
• 4.3.4 渗透胁迫条件下不同基因型悬浮培养细胞质壁分离差异比较
• 4.3.5 不同基因型拟南芥离体叶片失水速率差异比较
• 4.4 讨论
• 第五章 总结与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文目录