论文摘要
T、B淋巴细胞在机体免疫应答过程中需要两种信号的协同作用。第一信号为抗原与T细胞受体TCR的结合，第二信号为抗原递呈细胞上的协同刺激分子与T、B淋巴细胞上的受体结合。PD-1为T、B淋巴细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量约为50～55kD。在T、B细胞抗原受体激发后呈诱导性表达，也可表达于活化后的T、B细胞、单核细胞和髓系细胞，在胸腺及骨髓发育的特定阶段也可表达PD-1。PD-1与其两个配体PD-L1和PD-L2结合，在免疫应答中起着负性调控作用。为更好地了解PD-1分子在免疫调节中的作用，探讨PD-1作用的分子机制，本研究扩增了人PD-1基因，构建了重组逆转录病毒载体，筛选获得了能稳定高表达人PD-1分子的L929基因转染细胞，制备了抗人PD-1单克隆抗体，并对其生物学特性及对T细胞的影响进行了初步探讨。为进一步研究PD-1／PD-L信号在免疫调节中的作用，在临床肿瘤免疫、自身免疫性疾病以及移植免疫等疾病中的免疫干预，提供了实验基础和理论依据。 1、人PD-1 基因的扩增、在基因转染细胞PD-1／L929上的表达及其生物学功能的研究。采用PCR的方法，突变人PD-1全长基因的PstI位点，从本室构建的重组质粒pGEX-5X-3-PD-1中扩增出PD-1基因，并构建含PD-1基因的重组逆转录病毒载体，最终转染L929细胞，成功构建了稳定高表达PD-1分子的基因转染细胞株PD-1／L929，并探讨了PD-1／L929基因转染细胞对Mo-DC成熟的影响。结果显示，PD-1基因转染细胞可以促进DC的成熟，上调CD80和CD83的表达，但对CD86的作用不明显。此实验提示，PD-1／L929细胞可通过Mo-DC上的PD-L1分子产生逆向信号，从而介导生物学效应。 2、鼠抗人PD-1单抗的研制及其生物学特性研究。应用高表达人PD-1分子的PD-1／L929细胞为免疫原，常规方案免疫6～8周龄BALB／c小鼠。激发免疫后，将小鼠的脾脏细胞与小鼠SP2／0在PEG下融合，杂交瘤细胞经HAT选择培养获得。继而以PD-1／L929为筛选细胞，采用间接免疫荧光试验法，经流式细胞仪检测杂交瘤的培养上清中抗PD-1抗体的分泌。阳性克隆经有限稀释法多次亚克隆，至所有培养孔中的杂交瘤上清为阳性。实验先后共融合80块96孔板，筛选后最终获取2株持
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