论文摘要
猪是人异种器官移植理想的器官来源。体细胞核移植为人们生产不引起免疫排斥以及内源性病毒的猪提供了可能。成熟卵母细胞经移核后激活是核移植的关键步骤之一,卵母细胞的激活率直接影响核移植效率。当前核移植效率低下,其原因之一就是受体卵母细胞未被充分激活。本试验对影响体外成熟猪卵母细胞孤雌激活的因素进行研究,以便确定猪卵母细胞人工激活的最佳条件。试验比较了不同季节采集的卵巢对卵母细胞孤雌激活的影响;激活液中不同Ca2+浓度搭配不同电脉冲强度对卵母细胞和孤雌胚发育的影响;首次探讨了猪卵母细胞在甘露醇、山梨醇电激液以及此两种电激液等体积混合液中施加交流电的激活效果;比较了6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethyaminopurine,6-DMAP）、细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）、放线菌酮（cycloheximide,CHX）处理时间对卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响,并使用6-DMAP、CB、CHX先联合处理4h后,再用CHX单独作用2h的新方法对猪卵母细胞进行激活。结果表明:（1）春季采集的屠宰卵巢卵母细胞经体外成熟后孤雌激活,卵裂率和囊胚率最高,分别为79.70%和36.45%,极显著高于夏季和冬季（63.90%,16.80%;69.48%,20.13%,P＜0.01）;秋季虽然卵裂率显著低于春季,但囊胚率与春季差异不显著（P＜0.05）;（2）当Ca2+浓度较低时（0.01、0.05 mmol/L）,卵裂率和囊胚率都随搭配脉冲强度的升高而升高,0.05 mmol/L、1.6kV/cm与0.1 mmol/L、1.2kV/cm组卵裂率和囊胚率都极显著高于其余各组分别为73.75%;37.50%和74.74%;36.83%（P＜0.01）;当Ca2+浓度过高时（0.5 mmol/L）,无论搭配何种强度DC,其卵裂率和囊胚率都降低。（3）施加连续两次15μs,1.2kV/cm的直流脉冲,卵裂率和囊胚率与施加一次30μs同样脉冲强度结果相同,都显著高于施加连续两次30μs的直流脉冲;以两次间隔30min强度为1.2kV/cm的直流脉冲进行电激活,卵裂率和囊胚率都显著低于一次30μs直流脉冲;（4）以山梨醇为基本组分的电激液进行电激活,卵裂率、囊胚率先随脉冲强度的升高而升高,在1.6kV/cm时,卵裂率和囊胚率达到最高,分别为77.23%和34.15%,极显著高于1.0kV/cm和1.2kV/cm（P＜0.01）;与1.4kV/cm差异不显著（P＞0.05）。但随着脉冲强度进一步升高,孤雌发育能力明显下降;（5）与甘露醇电激液不同,直流脉冲前施加交流电,山梨醇液不能对孤雌胚胎发育起到促进作用;（6）将山梨醇、甘露醇电激液等体积混合,交流脉冲后进行电激活,1.2、1.6kV/cm组卵裂率分别72.33%和70.03%,囊胚率分别为31.03%和29.60%,虽然略低于甘露醇组（77.07%,36.03%）,但优于山梨醇组（69.63%,27.93%）,差异不显著（P＞0.05）。（7）电激后分别使用6-DMAP处理4h、CB处理4h、CHX处理6h能达到最佳激活效果,卵裂率和囊胚率分别为70.30%,32.68%;71.92%,30.14%和59.58%,19.16%:（8）6-DMAP、CB和CHX联合处理无论4h或6h,还是先联合处理4h再由CHX单独处理2h（4h+2h）,卵裂率都极显著高于三种化学药物单独处理（P＜0.01）;4h+2h对卵的激活效果与联合处理4h的处理效果相当;虽然卵裂率显著低于联合处理6h（P＜0.05）,但囊胚率极显著高于处理6h,分别为41.24%,35.60%（P＜0.01）;并且有接近一半的卵裂卵发育至囊胚。以上结果说明:春季和秋季为采集屠宰卵巢收集卵母细胞的最佳时间,这些时期采集的屠宰卵巢卵母细胞经体外成熟后,孤雌激活发育能力强;夏冬两季采集猪卵巢卵母细胞不适合用于体外培养。电激液中Ca2+浓度和脉冲强度低,卵激活效率低;Ca2+浓度和脉冲强度高,卵激活后发育效果可能会受到抑制。连续多次脉冲只引起一次猪胞内Ca2+浓度升高,一次卵细胞内Ca2+浓度升高就足以激活猪体外成熟卵母细胞;采用两次间隔30min的直流脉冲,不适合用于激活体外成熟卵母细胞。山梨醇液能够取代甘露醇液用于猪卵细胞的电激活;同时以山梨醇和甘露醇作为电激液的基本成分,可以用于猪卵母细胞的电激活或融合。电激后再使用化学试剂继续激活,6-DMAP激活效以处理4h最好,CB激活效果以处理4h最好,CHX激活效果以处理6h最好。6-DMAP、CB、CHX先联合处理4h再由CHX单独处理2h,有较好的激活效果,可以作为体外成熟猪卵母细胞人工激活的方式。总之,在春秋两季采集的卵母细胞经过成熟培养,在甘露醇激活液中以单次持续30μs,强度为1.2kV/cm直流脉冲电激活后,先由6-DMAP、CB和CHX联合处理4h,再由CHX单独处理2h,能获得最佳孤雌发育效果;山梨醇以及山梨醇和甘露醇混合电激液能够用于猪卵母细胞人工激活,但相关参数仍需进一步研究。