Dpr1和Dpr2在调节Wnt/TGF-β信号中的作用

论文摘要

Dapper(Dpr)蛋白家族中不同的成员:Dapper1(Dpr1)和Dapper2(Dpr2)蛋白,在先前爪蟾的研究以及我们克隆得到的斑马鱼Dapper2蛋白在斑马鱼中的研究中已经发现,它们能够分别调控Wnt和TGFβ信号通路。为了能够对Dapper这一家族蛋白在哺乳动物中的功能做进一步的研究,我们克隆了斑马鱼Dapper2蛋白在小鼠中的同源蛋白mDpr2并对其在调控TGFβ信号通路中的作用进行了研究。我们的研究发现,和斑马鱼zDpr2的功能相类似,在哺乳动物细胞中过量表达mDpr2蛋白能够诱导TGFβI型受体的降解,从而抑制TGFβ诱导的下游报告基因的表达。特异性抑制内源mDpr2的RNA干扰也能上调TGFβ报告基因的表达。这些研究结果揭示了Dpr2作为进化上保守的TGFβ逆调控因子而存在。Wnt信号在胚胎发育和癌症发生中起很重要的作用,爪蟾中的Dpr蛋白作为Dishevelled(Dvl)的结合蛋白被发现,并证实在Wnt信号中起作用。但其哺乳动物(人与小鼠)的同源蛋白Dpr1,是否也起到相类似的作用,是否如Dpr2蛋白一样能够调控TGFβ信号,都不得而知。因此,我们克隆得到了人和小鼠的Dapper1基因并发现,与Dpr2蛋白不同,哺乳动物的Dpr1基因能够明显的抑制经典Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路。通过相互作用区段的分析,我们鉴定了Dpr1蛋白和Dvl2蛋白的相互作用区段主要是通过Dpr1蛋白的C端区域结合Dvl2蛋白的DEP结构区域。利用Wnt信号的报告基因,我们发现,Dpr1对Wnt信号呈现的抑制作用需要该蛋白各个区段一起的参与,单独表达Dpr1的C端225个氨基酸区段对Wnt报告基因表现出来的激活证明了该区段是Dpr1的显形失活区域。深入的研究我们发现,Dpr1蛋白能够通过结合Dvl2蛋白诱导其通过溶酶体降解。特异性抑制内源Dpr1的RNA干扰不仅能够上调Wnt信号,而且能够增加内源Dvl2的蛋白表达。从而,我们的工作也证实了Dpr1是进化上保守的Wnt信号的抑制因子。为了深入地研究Dapper家族蛋白的生物学功能,本课题克隆了Dpr1/Dpr2在酵母中表达的诱饵蛋白,利用人胎儿脑文库cDNA完成了酵母双杂交,为以后的研究奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 Wnt 及其信号转导通路
• 1.1.1 Wnt 蛋白
• 1.1.2 Wnt 信号通路
• 1.1.3 Wnt 信号转导通路成分及其功能
• 1.1.4 Wnt 信号通路在肿瘤中的作用
• 1.2 TGFβ及其信号转导通路
• 1.2.1 TGF-β配体
• 1.2.2 TGF-β受体类型、结构及功能
• 1.2.3 Smads 蛋白的结构及功能
• 1.2.4 Smad 蛋白的DNA 结合活性和转录调节功能
• 1.2.5 非依赖于Smads 的TGFβ信号
• 1.3 Dapper 蛋白家族的研究
• 1.3.1 Dapper/Frodo 蛋白研究概述
• 1.3.2 Dapper/Frodo 蛋白一级序列保守性分析
• 1.4 本课题的研究目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验仪器设备及试验材料
• 2.1.1 主要的试验仪器设备
• 2.1.2 试验材料
• 2.1.3 溶液配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒构建
• 2.2.2 蛋白纯化
• 2.2.3 Dapper1 和Dapper2 特异性多克隆抗体的制备
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 细胞转染
• 2.2.6 免疫印迹
• 2.2.7 免疫共沉淀
• 2.2.8 报告基因检测
• 2.2.9 免疫荧光
• 2.2.10 基因组DNA 的提取
• 2.2.11 蛋白（抗体）浓度测定
• 2.2.12 细胞RNA 提取和RT-PCR 检测
• 第3章 斑马鱼Dapper2 调节TGFβ信号
• 3.1 班马鱼Dapper2 抑制TGFβ信号
• 3.2 班马鱼Dapper2 结合TGFβ/Nodal 受体
• 3.3 班马鱼Dapper2 促进TGFβ/Nodal 受体内吞和溶酶体降解
• 3.4 班马鱼Dapper2 抑制Smad2 的磷酸化
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第4章 Dapper2 调节TGFβ信号具有进化保守性
• 4.1 小鼠Dapper2 抑制TGFβ信号
• 4.1.1 过量表达Dapper2 抑制TGFβ报告基因的激活
• 4.1.2 siRNA 抑制内源Dapper2 的表达上调TGFβ报告基因
• 4.2 小鼠Dapper2 结合 TGFβI 型受体促进其溶酶体降解
• 4.2.1 mDpr2 结合TGFβI 型受体
• 4.2.2 mDpr2 诱导TGFβI 型受体溶酶体降解
• 4.3 mDpr2 在TGFβ信号通路中功能区域的鉴定
• 4.3.1 m Dpr2 缺失突变体的构建及表达
• 4.3.2 m Dpr2 全长以及缺失突变体对TGFβ信号的作用
• 4.3.3 m Dpr2 全长以及缺失突变体对TGFβ信号的作用
• 4.4 Dapper2 抗体的制备
• 4.4.1 抗原制备（详见材料与方法）
• 4.4.2 抗体制备及检测（详见材料与方法）
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 第5章 Dapper1 调控Wnt 信号转导
• 5.1 Dapper1 全长表达载体的构建
• 5.1.1 人Dapper1 编码区全长序列的克隆
• 5.1.2 小鼠Dapper1 编码区全长序列的克隆
• 5.2 Dapper1 抗体的制备
• 5.2.1 抗原制备（详见材料与方法）
• 5.2.2 抗体制备及检测（详见材料与方法）
• 5.3 初步鉴定Dapper1 和Dapper2 全长在TGFβ/Wnt 信号中的作用
• 5.3.1 Dapper1 和Dapper2 在TGFβ信号中的不同作用
• 5.3.2 Dapper1 和Dapper2 在Wnt 信号中的不同作用
• 5.4 Dapper1 和Dapper2 全长在其他信号通路中的作用
• 5.5 Dapper1 抑制Wnt1 和Dvl2 激活的经典Wnt 信号
• 5.5.1 过表达Dapper1 抑制Wnt1 和Dvl2 对Wnt 报告基因的激活
• 5.5.2 Dapper1 siRNA 和Dvl2 的表达回复Dapper1 对Wnt 信号的抑制
• 5.6 Dapper1 与Dvl2 的蛋白－蛋白相互作用
• 5.6.1 内源Dapper1 与Dvl2 的结合
• 5.6.2 内源Dapper1 的定位以及与Dvl2 的共定位
• 5.6.3 Dapper1 和Dvl2 相互作用区段的检测
• 5.7 Dapper1 诱导Dvl2 蛋白的溶酶体降解
• 5.8 Dapper1 结合Wnt 下游GSK3β、β-catenin、LEF-1 等关键因子
• 5.9 Dapper1 结合Dapper2
• 5.10 讨论
• 5.11 小结
• 第6章 酵母双杂交筛选与Dapper1 和Dapper2 相互作用的蛋白
• 6.1 Dapper1 和Dapper2 的结构区域与功能
• 6.1.1 Dapper1 和Dapper2 在缺失突变体的构建
• 6.1.2 Dapper1 和Dapper2 缺失突变体的功能
• 6.2 Dapper1 和Dapper2 作用小结
• 6.3 Dapper1 和Dapper2 的深入研究策略
• 6.4 Dapper1 和Dapper2 酵母双杂交的开展
• 6.4.1 酵母双杂交的原理以及概述
• 6.4.2 经典的酵母双杂交成果的概述
• 6.4.3 Dapper 诱饵蛋白的构建表达以及酵母双杂交策略的选择
• 6.5 Dapper1 和Dapper2 酵母双杂交结果以及分析
• 6.6 讨论
• 6.7 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果