新疆家蚕抗菌肽的分子改造及其结构与功能的关系

论文摘要

自20世纪70年代末,H.boman等首次在惜古比天蚕中发现天蚕抗菌肽以来,由于抗菌肽类物质分子量较小,具有良好的热稳定和水溶性,以及广谱抗菌等特点,而且与抗生素的抗菌机理完全不同,已成为转基因抗病动植物的基因来源和新型抗菌、抗癌药物研究开发的目标,有着广阔的发展前景。随着对抗菌肽结构、功能和杀菌机理的不断了解,人们开始对其结构进行改造。通过重新设计抗菌肽分子,来研究抗菌肽结构与功能的关系,并期望获得更加高效、低毒的抗菌肽产品已经成为抗菌肽研究的一个重要内容。目前已经发现的抗菌肽,几乎所有都含有大量带正电荷的氨基酸,在本质上都是阳离子型的;在抗菌肽高级结构中,按照肽链结构可分为4类:即α-螺旋、β-折叠、环形、伸展性结构。无论抗菌肽是以α-螺旋,β-折叠还是环形形式出现,两亲结构（具有两个表面,一个亲水,一个疏水）是其共同特征。α-螺旋两亲抗菌肽的主要特点是抗菌肽分布广,数量多,并具有广谱抗性;肽链长度短（<40个氨基酸残基）,易于化学合成和进行结构测定;同时抗菌机理的研究较为明确。因此,目前将α-螺旋两亲抗菌肽的肽链结构作为主要的研究对象。尽管到目前为止还没有对抗菌肽的作用机制有一个详细的了解,但是许多实验表明,α-螺旋抗菌肽分子通过其两性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上,紧接着抗菌肽分子的疏水段借助于分子中AGP连接的柔性插入到质膜中,然后抗菌肽分子两亲α-螺旋也插入到质膜中,这样就破坏了脂质双分子层原有的有序结构,由于α-螺旋的两亲性使抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起,从而在膜上形成离子通道,细菌最终不能保持正常渗透压而致死。α-螺旋抗菌肽的分子结构和抑菌机理表明,抗菌肽的肽链结构,阳离子数量和疏水性与功能密切相关。因此,抗菌肽的结构功能研究以及分子设计,主要从以上三个方面展开。本研究以新疆家蚕cecropin-XJ基因为基础,围绕正电荷含量、疏水性和肽链结构,设计了8个修饰基因:cecropin-M1,cecropin-M2,cecropin-M3,cecropin-M4 , cecropin-M5 , cecropin-M6, cecropin-M7 , cecropin-M8 ,其中cecropin-M1,cecropin-M2,cecropin-M3,cecropin-M4,cecropin-M8使用PCR扩增,cecropin-M5,cecropin-M6,cecropin-M7采用化学合成,修饰基因经过酶切后,构建至pGEX-4T- 1原核表达载体上,利用大肠杆菌BL21表达融合蛋白。SDS-PAGE结果表明所有融合蛋白都得到了表达,其中cecropin-M1为包涵体,其余均为可溶蛋白。经测定,蛋白最佳诱导条件为诱导时间4h,IPTG浓度0.5mM。随后,利用GST树脂纯化大量诱导表达的融合蛋白,经过冷冻干燥后,得到纯化蛋白样品。通过体内抑菌实验和MIC（最低抑菌浓度实验）,对纯化的蛋白进行功能检测。体内抑菌实验结果显示8种经过修饰的抗菌肽均能够抑制大肠杆菌BL21生长,经MIC测定cecropin-M4和cecropin-M8活性最高,分别达到0.16mg/mL和0.19mg/mL,比原cecropin-XJ活性提高了三倍左右。而cecropin-M6和cecropin-M7活性则有较大下降。这一发现将为今后通过分子生物学手段提高抗菌肽活性提供一定科学理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述
• 第一章 抗菌肽结构与功能关系及分子改造研究进展
• 1 抗菌肽的结构与功能
• 2 抗菌肽的影响因素
• 3 抗菌肽的结构改造方法
• 4 目前存在的问题和应对措施
• 5 展望
• 参考文献
• 第二部分 实验内容
• 第二章 新疆家蚕抗菌肽的分子改造及其结构与功能的关系
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 pGEX- 4T-1-cecropin-M 重组质粒的构建
• 1.5 GST-cecropin-M 的诱导表达及纯化
• 1.6 重组抗菌肽的活性检测
• 2 结果与分析
• 2.1 pGEX-4T-1-cecropin-M 重组质粒的构建
• 2.2 GST-cecropin-M 的诱导表达及纯化
• 2.3 重组抗菌肽的活性检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论与展望
• 致谢
• 个人简历