α-乙酰乳酸脱羧酶基因工程菌株构建及产酶条件优化

论文摘要

双乙酰是啤酒中的重要风味物质，但含量过高会影响啤酒的品质。双乙酰的口味阈值很低，仅为0.1～0.15mg／L，超过此阈值会给啤酒带来不愉快的馊饭味，所以传统的啤酒酿造需要一个很长的低温贮藏期来降低双乙酰的含量。α-乙酰乳酸脱羧酶（α-acetolactate decarboxylase，α-ALDC，EC.4.1.1.5），它能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸迅速地分解为乙偶姻，从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量，促进啤酒的成熟并缩短发酵周期，从而提高了设备的利用率及降低生产成本。本文构建了低双乙酰产量的酵母基因工程菌株。首先通过PCR的方法，根据GenBank中登陆的ALDC基因序列（L04470）设计了5’端引物和3’端引物，以枯草芽孢杆菌菌体为模板克隆到了ALDC基因，全长780bp，与GenBank中登陆的序列进行比对，达到93.6％的同源性。然后将获得的基因连接到表达质粒载体pYC6／CT上，采用醋酸锂转化法将重组表达载体pYC6／CT-ALDC转化进入酵母HDY-01中，利用pYC6／CT上带有的Blasticidin抗性基因来筛选转化子，进而对转化子的酶蛋白进行活性检测，从而在诸多转化子中筛选到基因得以稳定表达的重组子，选择酶活性较高的一株进行α-乙酰乳酸脱羧酶产酶条件的优化及发酵参数的检测，结果表明：在诸多转化子中1-27菌株酶活性最高，达到0.0081U／mL，对产酶条件进行优化表明，在36h、30℃、10％接种量条件下酶活较高，达到0.0087U／mL。同时对1-27菌株的发酵条件研究表明：在3％的接种量，13℃的条件下，双乙酰含量在第8天降到0.025ppm。对乙醛等12种风味物质的检测表明转化菌株的各项指标均符合啤酒酿造的标准，本试验为构建双乙酰低产量的工程酵母奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 α-乙酰乳酸脱羧酶概述
• 1.1.1 α-乙酰乳酸脱羧酶的来源
• 1.1.2 α-乙酰乳酸脱羧酶的酶学及物理化学性质
• 1.1.3 α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列
• 1.2 α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒酿造中的应用
• 1.2.1 双乙酰的形成机制
• 1.2.2 α-乙酰乳酸脱羧酶与啤酒成熟
• 1.2.3 啤酒酿造中控制双乙酰含量的主要方法
• 1.3 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及表达的研究概况
• 1.3.1 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在细菌中的克隆与表达
• 1.3.2 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母中的克隆与表达
• 1.4 优化产酶条件及发酵参数的选择
• 1.5 本研究的目的意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ALDC基因的克隆
• 2.2.2 重组质粒DNA pYC-ALDC的构建
• 2.2.3 转化酵母
• 2.2.4 表达重组子的验证
• 2.2.5 ALDC酶活的测定
• 2.2.6 重组子产酶条件优化
• 2.2.7 三角瓶发酵实验
• 第3章 结果
• 3.1 ALDC基因的克隆
• 3.2 重组质粒DNA pYC-ALDC的构建
• 3.3 转化酵母
• 3.4 表达重组子的验证
• 3.5 ALDC酶活的测定
• 3.6 重组子产酶条件优化
• 3.7 三角瓶发酵实验
• 第4章 讨论
• 4.1 本课题的研究背景
• 4.2 实验方法的讨论
• 4.3 外源基因在酿酒酵母中的表达
• 4.4 重组菌株的ALDC活性
• 结论
• 参考文献
• 致谢