CD133在肝癌干细胞中的表达及作用

论文摘要

1CD133对人类肝细胞癌恶性潜能的影响目的：探讨CD133表达对人类肝细胞癌恶性潜能的影响。方法：检测有CD133表达的HCC细胞的癌变特性。结果：在5个HCC组织中,有CD133表达的细胞很少。我们通过下面两种方法衍生出两个不同的HCC细胞系：（1）在PLC/PRF/5细胞中转入CD133的siRNA （CD133si-PLC/PRF/5）,（2）磁珠法筛选出含有CD133和不含有CD133的细胞株。在敲除了CD133的PLC/PRF/5细胞中,MMP-2和ADAM9在mRNA水平和蛋白水平检测出明显下降。之后,我们检测出现MM-2和PADAM9T降的HCC细胞的癌变特性。在CD133si-PLC/PRF/5细胞和CD133-Huh7（CD133缺失）细胞中,肿瘤侵袭力和VEGF（血管内皮生长因子）都被抑制,这些与MMP-2的活性相关,而这种现象在有CD133表达的HCC细胞中不存在。我们之前的研究表明ADAM9蛋白酶对MICA起着关键作用,而MICA与自然杀伤细胞（NK）的灵敏度有关。在CD133si-PLC/PRF/5细胞的和CD133-Huh7细胞中降低ADAM9表达导致膜结合MICA的增加和可溶性MICA的减少。CD133si-PLC/PRF/5细胞和CD133-Huh7细胞对NK细胞的活性很敏感,这取决于膜结合MICA的表达水平,但有CD133表达的肝癌细胞则没有这些特性。结论：CD133表达加强了肝癌细胞的恶性潜能,促使肝癌存活。2CD133表达对肝癌侵袭及上皮间质转化的影响目的：探讨表达CD133肝癌干细胞的生物特性。方法和结果：采用细胞迁移实验分析细胞迁移能力,通过实时PCR法分析HepG2,Hep3B,Huh7,PLC/RFP/6,SNU423,SNU449,和SNU475等肝癌细胞系中的CD133、侵袭相关基因（活剂受体（uPAR）,绒毛蛋白2（VIL2）/MMP1和MMP2）,和EMT调控剂（Snail, Slug,Twist,E-cadherin,and N.-cadherin）的mRNA表达水平。同样也对病毒性乙型肝炎引起肝癌中49个样本进行了相同基因检测已经病理特征分析。在所有的肝癌细胞系中,CD133阳性细胞比阴性细胞的细胞迁移性活跃,上调侵袭性和上皮细胞-间充质转化的相关基因中N-钙黏素的表达增加,而E-钙黏蛋白表达降低。本实验将肝癌细胞按CD133mRNA的含量分成高CD133组（CD133含量最高的40%标本）和低CD133组（CD133含量最低的40%标本）。同低CD133组相比,高CD133组的血管侵犯频繁,侵袭性相关基因[uPAR（p=0.002）,MMP1（p=0.01）,and MMP2（p=0.003）]和EMT调节因子[Snail（p=0.002）and Twist（p=0.0003）]的表达含量高。结论：HCC中CD133高表达,CD133高表达肝癌细胞能通过上调侵袭性相关基因和EMT相关基因而产生更强的侵袭性。3CD133表达对肝癌细胞株HepG2顺铂化疗敏感性的影响目的：探讨CD133表达与肝癌细胞株HepG2对顺铂化疗敏感性的关系。方法和结果：CD133（+）细胞较CD133（一）在体内肿瘤形成中发挥较重要的作用,但是在自然环境下,CD133（+）能阶段性分化成CD133（—）,CD133（—）却不能分化成CD133（+）细胞。另外,CD133（+）细胞较CD133（-）对顺铂更有抗性,其机制与p-1整合蛋白高表达有关,p-1整合蛋白高表达是CD133+与胶原蛋白结合能力强。p-整合蛋白功能受损能恢复肝癌细胞顺铂敏感性。结论：CD133阳性表达肝癌细胞具有顺铂化疗抗性,其机制可能与β1整合蛋白信号通路有关。4CD133表达对肝癌细胞株HepG2放疗敏感性的影响目的探讨CD133表达对肝癌细胞放疗敏感性的影响,寻求改善肝癌放疗疗效的新途径。方法磁分离法分离CD133阳性及阴性HepG2细胞,流式细胞仪检测CD133在两组细胞中表达及稳定性。筛选获得亚克隆细胞,Western blot法检测CD133表达情况。丫射线照射后,采用MTS比色法检测癌细胞体外生长活性；Annexin V/FITC和碘化丙啶双染色流式细胞仪法检测癌细胞凋亡及比率；Western blot检测细胞内PANC,Bcl2,cPRAP,Erk,Jnk,Akt等表达,裸鼠皮下注射检测细胞成瘤能力。结果与CD133-细胞相比,CD133+细胞放射处理后MAPK/PI3K活性更高,活性氧簇产量更少。裸鼠体内成瘤实验表明经放射处理后的CD133+细胞成瘤能力高于CD133-细胞,表明CD133在肝癌细胞放射抵抗作用中起着重要作用。结论肝癌细胞通过表达CD133激活MAPK/ERK生存信号通路发挥抗放射活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 1 CD133对人类肝细胞癌恶性潜能的影响
• 1.1 引言
• 1.2 主要材料和方法
• 1.2.1 主要材料
• 1.2.2 主要方法
• 1.2.3 统计方法
• 1.3 结果
• 1.3.1 肝癌组织中CD133阳性细胞及肝癌细胞株中CD133表达情况的检测
• 1.3.2 MMP-2及ADAM9在CD133si、control-PLC/PRF/5细胞和CD133+/-Huh7细胞中的表达情况
• 1.3.3 CD133si-/control-PLC/PRF/5细胞和CD133+/-Huh7细胞的侵袭能力
• 1.3.4 CD133 si-/control-PLC/PRF/5细胞和CD133+/-Huh7细胞表达及分泌血管内皮生长因子（VEGF）能力的情况
• 1.3.5 CD133表达抑制后,PLC/PRF/5细胞中MICA表达及的NK细胞溶解活性变化情况
• 1.3.6 CD133+/-Huh7细胞中膜结合MICA的表达和可溶性MICA的产生情况以及NK细胞对CD133+/-Huh7细胞的细胞毒活性
• 1.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 2 CD133对肝癌侵袭及上皮间质转化的影响
• 2.1 引言
• 2.2 主要材料和方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 主要方法
• 2.2.3 统计学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 HCC细胞株中CD133表达情况及细胞迁移能力分析
• 2.3.2 根据CD133mRNA表达水平对人类肝癌组织进行分类并比较其病理特征
• 2.3.3 CD133mRNA表达水平和肝癌细胞系及肝癌组织侵袭性相关基因表达的相关性分析
• 2.3.4 CD133mRNA表达水平和肝癌细胞系及肝癌组织上皮间质转化相关基因表达的相关性分析
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 3 CD133表达对肝癌细胞株HepG2顺铂化疗敏感性的影响
• 3.1 引言
• 3.2 主要材料和方法
• 3.2.1 主要试剂及仪器
• 3.2.2 主要方法
• 3.2.3 统计学处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 CD133在肝癌细胞系HepG2表达中的表达情况
• 3.3.2 CD133分选细胞后,CD133阳性与阴性细胞中CD133表达变化情况
• 3.3.3 CD133阳性与阴性HepG2细胞迁移能力比较
• 3.3.4 CD133阳性与阴性HepG2细胞在SCID小鼠中的成瘤能力
• 3.3.5 CD133在皮下肿瘤中分离细胞中的表达
• 3.3.6 CD133阳性与阴性肝癌细胞对顺铂化学敏感性的差异
• 3.3.7 整合蛋白的细胞表面表达情况以及细胞外基质蛋白结合能力分析
• 3.3.8 胶原及琼脂糖凝胶中顺铂化学敏感性的比较
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 4 CD133表达对肝癌细胞株HepG2放疗敏感性的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要试剂及仪器
• 4.2.2 主要方法
• 4.2.3 统计学处理
• 4.3 结果
• 4.3.1 HepG2γ射线照射后CD133+细胞富集
• 4.3.2 γ射线照射对肝癌HepG2细胞周期阻分布的影响
• 4.3.3 γ射线照射对CD133+HepG2细胞凋亡的影响
• 4.3.4 γ射线照射对CD133+HepG2细胞增殖的影响
• 4.3.5 γ射线照射对CD133阳性及阴性HepG2细胞产生ROS的影响
• 4.3.6 γ射线照射对CD133阳性及阴性HepG2细胞致瘤能力的影响
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 攻读学位期间主要研究成果
• 致谢