奶牛子宫内膜炎致病大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究

论文摘要

子宫内膜炎是导致奶牛不孕症的生殖系统疾病之一。该病主要由分娩或产后子宫感染病原微生物引起。临床上多使用抗微生物药物对其进行治疗,在药物选择压力作用下,病原菌中的耐药菌株不断增多,不仅影响了畜牧业的良性发展,而且动物源性病原菌对抗微生物药物耐药性的形成也给人类健康带来了严重的潜在威胁。因此,为了对引起奶牛子宫内膜炎的病原菌进行危害性分析和评估,并指导临床合理用药,本研究对内蒙古呼和浩特市周边地区分离的奶牛子宫内膜炎大肠杆菌进行了血清型鉴定和MICS值测定。研究发现,该地区奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的分离率为54.3%（57/105）,且分离菌株的优势血清型为O111:K58（B4）。57株大肠杆菌对磺胺类、苄胺嘧啶类、四环素、头孢唑啉、广谱青霉素类的氨苄西林、阿莫西林和氨基糖苷类的卡那霉素、链霉素以及氯霉素、多粘菌素E的耐药率较高,在5098%之间;而对头孢噻呋、呋喃唑酮和氟喹诺酮类药物较为敏感,耐药率在13.735%之间。采用PCR技术和直接测序对临床分离菌株中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ整合子/基因盒及超广谱β-内酰胺酶（ESBLS）不同型别基因的分子流行病学进行了调查和分析。结果表明,其中Ⅰ型整合子的检出率为36.8%,未检出Ⅱ、Ⅲ型整合子。对Ⅰ型整合酶基因阳性菌株进行基因盒插入区扩增,并克隆测序,结果显示,呼和浩特市周边地区奶牛子宫内膜炎致病性大肠杆菌中有7种基因盒流行,分别编码了对甲氧苄啶（dhfr, dfrA1, dfrA17, dfr2d）和氨基糖苷类药物（aadA1、aadA2、aadA5）的耐药性。其中,基因盒排列dfrA17-aadA5（69.1%）和dfrA1-aadA1（42.9%）流行最为广泛。通过分析57株大肠杆菌的耐药表型和Ⅰ型整合子/基因盒分子流行病学特征发现,菌株是否携带Ⅰ型整合子与其多重耐药水平有密切关系。整合子阳性菌株更趋于多重耐药,且所携带的耐药基因盒可解释菌株对磺胺、甲氧苄啶、氨基糖苷类的耐受性,而菌株对β-内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类药物的耐药表型与其是否携带Ⅰ型整合子及耐药基因盒相关性不强。本研究考察了不同型别ESBLS基因CTX、SHV和TEM在以上分离菌中的流行情况,结果发现TEM型基因最为流行,检出率为77.2%,而未检出其他两种基因型别。通过分析blaTEM基因阳性菌株与阴性菌株对β-内酰胺类药物的耐药情况,发现质粒介导的ESBLS的产生和传播是导致分离菌株对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制。从95.2%的Ⅰ型整合子阳性菌株质粒DNA上扩增出了TEM型ESBLS基因,此结果表明Ⅰ型整合子在产ESBLS菌株中的广泛分布,使耐药基因更易于在细菌间快速散播。随后,采用PCR技术从11株耐氟喹诺酮类药物的奶牛子宫内膜炎大肠杆菌中扩增了gyrA、parC、gyrB和parE基因的喹诺酮耐药决定区（QRDR）,通过对PCR产物克隆测序,发现有4株菌GyrA亚基发生了Ser83→Leu、Asp87→Asn的氨基酸替代;11株菌GyrB亚基上均发生了Pro385→Ala;有2株耐药菌的ParE亚基发生了Ser458→Ala氨基酸替代;本研究首次发现了ParC亚基上发生的Ser58→Ile、Arg138→Asp、Arg138→Val、Pro140→Thr、Asn141→Lys氨基酸替代类型,并且证明ParC亚基上发生的氨基酸替代是该地区11株耐药菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性的主要机制之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 奶牛子宫内膜炎研究进展
• 1.1 奶牛子宫内膜炎的分类和临床症状
• 1.2 奶牛子宫内膜炎的病因
• 1.3 奶牛子宫内膜炎的发病机理
• 1.4 奶牛子宫内膜炎的诊断
• 1.5 奶牛子宫内膜炎的治疗
• 2 细菌耐药性的产生及扩散机制
• 2.1 细菌耐药性的产生机制
• 2.2 细菌的耐药性的扩散机制
• 3 细菌对氟喹诺酮类药物耐药机制研究进展
• 3.1 细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制
• 3.2 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药特点
• 4 研究的目的和意义
• 第一章 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的分离、鉴定及其致病性、耐药性研究
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 药品、培养基及其它试剂
• 2 试验方法
• 2.1 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的分离与初步鉴定
• 2.2 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的生化鉴定
• 2.3 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的血清型鉴定
• 2.4 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的致病性研究
• 2.5 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的体外药物敏感性测定
• 3 试验结果
• 3.1 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的分离鉴定
• 3.2 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的血清型鉴定
• 3.3 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的致病性测定结果
• 3.4 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌体外药物敏感性研究
• 4 讨论
• 4.1 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的分离情况
• 4.2 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的血清型分布
• 4.3 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌的致病性
• 4.4 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌分离株的体外药物敏感性
• 4.5 奶牛子宫内膜炎的治疗前景
• 第二章 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌整合子/基因盒分子流行病学分析
• 1 试验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器及设备
• 2 试验方法
• 2.1 菌株的收集、分离与鉴定
• 2.2 菌株体外药敏试验
• 2.3 PCR 检测整合子及基因盒
• 2.4 PCR 扩增产物电泳分析及回收
• 2.5 插入区基因盒目的片段的连接及转化
• 2.6 基因盒插入区片段的测序
• 2.7 同类大小基因盒插入区片段的酶谱分析
• 2.8 基因盒插入区片段序列与登录基因盒序列及其翻译蛋白氨基酸序列比较
• 3 试验结果
• 3.1 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合酶基因检测结果
• 3.2 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌Ⅰ型整合子测结果
• 3.3 菌落PCR与菌株总DNA模板PCR、质粒DNA模板PCR结果比较
• 3.4 临床分离菌株Ⅰ型整合子基因盒插入区PCR扩增结果及序列分析
• 3.5 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌中各种Ⅰ型整合子的流行情况
• 3.6 整合子阳性和阴性菌株耐药表型分析
• 4 讨论
• 4.1 Ⅰ型整合子/基因盒流行病学及其与动物源性大肠杆菌耐药性的关系
• 4.2 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌中流行的各种Ⅰ型整合子
• 4.3 Ⅰ型整合子/基因盒的检测方法
• 第三章 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶基因的流行病学调查
• 1 试验材料
• 1.1 病原菌
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂盒
• 1.4 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 PCR 扩增模板的制备
• 2.3 不同型别ESBLs 基因的PCR 检测
• 2.4 PCR 产物电泳分析
• 2.5 目的片段测序分析
• 3 试验结果
• SHV、bla_ctx和bla_TEM基因的检测结果'>3.1 bla_SHV、bla_ctx和bla_TEM基因的检测结果
• TEM 基因阳性、阴性菌株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药情况'>3.2 bla_TEM基因阳性、阴性菌株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药情况
• 3.3 整合子阳性菌株中ESBLs 基因的检出情况
• 4 讨论
• 4.1 β-内酰胺酶与细菌耐药性产生间的关系
• 4.2 整合子在产超广谱β-内酰胺酶菌株耐药性扩散中的作用
• 第四章 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌氟喹诺酮类耐药株基因突变研究
• 1 试验材料
• 1.1 标准菌株
• 1.2 试剂盒
• 1.3 克隆载体
• 1.4 DNA 分子量标准
• 1.5 其他试剂
• 1.6 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物的设计和合成
• 2.2 染色体 DNA 的提取
• 2.3 大肠杆菌gyrA、gyrB、parC 和parE 基因的扩增
• 2.4 PCR 产物电泳分析
• 2.5 PCR 产物的回收
• 2.6 目的片段的连接与转化
• 2.7 目的片段成功克隆的确认
• 2.8 目的片段的核苷酸序列测定
• 2.9 测序结果分析
• 3 试验结果
• 3.1 奶牛子宫内膜炎大肠杆菌 gyrA、gyrB、parC 和 parcE 基因片段扩增结果
• 3.2 氟喹诺酮耐药菌株 gyrA、parC、gyrB 和 parE 基因测序结果及分析
• 3.3 氟喹诺酮类耐药菌株 gryA、ParC、gyrB、parE 基因突变与耐药表型的关系
• 4 讨论
• 4.1 PCR 方法在细菌对氟喹诺酮类药物耐药机制研究中的应用
• 4.2 氟喹诺酮耐药菌株 gyrA 和 parC 基因突变分析
• 4.3 氟喹诺酮耐药菌株 gyrB 和 parE 基因突变分析
• 4.4 菌株 GyrA、GyrB、ParC 和 ParE 亚基变化与氟喹诺酮类耐药水平的关系
• 结论
• 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介