鸡C3d-P29分子佐剂作用效果的研究

论文摘要

基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子ɑ链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此C3d被认为是基因疫苗的有效的分子佐剂。新城疫病毒DNA疫苗是以新城疫病毒的F基因和HN基因为主要抗原基因的核酸疫苗。F蛋白即融合蛋白,是NDV一种较大的糖蛋白,是NDV感染细胞所必需的,是构成NDV致病力的重要成分。以F基因为免疫原研制基因疫苗是进行NDV分子免疫学防治的基本策略。本研究以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂与新城疫病毒的F基因连接,构建了NDV F基因-C3d-p29分子佐剂疫苗,并对其免疫效果进行了初步研究。主要研究内容如下:试验一、AA肉鸡补体C3d cDNA的克隆AA肉鸡肝脏经大肠杆菌活化后,液氮研磨法提取肝细胞总RNA。根据GenBank发表序列,利用Primer5软件设计一对引物,RT-PCR扩增C3d基因的cDNA。RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳后克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,根据测序结果推导氨基酸序列。结果表明AA肉鸡C3d基因与莱杭鸡的同源性为99.5%,证明得到了AA肉鸡C3d基因。比较鸡与其他动物及人的CR2结合区,发现为鸡与哺乳动物的同源性低,不足40%,而哺乳动物之间的同源性近80%。这表明CR2结合区具有种属的特异性。试验二、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pCDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗。对3周龄SPF鸡进行基因免疫,结果pCDNA-F-P29.4、pCDNA-F-P29.6较pCDNA-F都能够提高HI抗体水平及保护力,虽然HI抗体水平不及灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,并且pCDNA-F-P29.6效果更好。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 一、核酸疫苗研究进展
• 1. 核酸疫苗的历史
• 2. 核酸疫苗的结构
• 3. 核酸疫苗的作用机理
• 4. 核酸疫苗的优点及不足
• 4.1 核酸疫苗的优点
• 4.2 核酸疫苗的不足
• 5. 影响核酸疫苗免疫效果的因素
• 5.1 从优选择目的基因
• 5.2 获得外源基因在机体内的高效表达
• 5.3 接种前组织预处理
• 5.4 基因疫苗导入方法
• 6. 增强 DNA 疫苗免疫效果的策略
• 6.1 CpG DNA （ODN）佐剂
• 6.2 细胞因子佐剂
• 二、补体 C3d 研究进展
• 1. C3d 的分子结构
• 2. C3d 的分子佐剂作用
• 3. C3d 的可能的作用机制
• +细胞对与 C3d 偶联抗原的摄取'>3.1 促进 CR2⁺细胞对与 C3d 偶联抗原的摄取
• 3.2 利于抗原向次级淋巴组织的运输
• 3.3 促进膜分子 B7 的表达
• 3.4 降低 B 细胞的活化阈值
• 3.5 利于生发中心的形成
• 3.6 促进抗体亲和力成熟和记忆性 B 淋巴细胞的形成
• 三、鸡新城疫病毒F 基因分子生物学特征
• 四、新城疫F 基因疫苗
• 五、本研究的目的及意义
• 试验一、AA 肉鸡补体 C3d cDNA 的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 载体
• 1.1.3 试剂及试剂盒
• 1.1.4 试剂动物
• 1.1.5 主要仪器
• 1.1.6 试验所用溶液及其配制
• 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理
• 1.2 方法
• 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 RT- PCR 扩增 C3d cDNA
• 1.2.4 制作感受态细胞
• 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接
• 1.2.6 连接物的转化
• 1.2.7 重组质粒的鉴定
• 1.2.8 测定
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA，及其PCR、酶切鉴定
• 2.2 AA 肉鸡C3d cDNA 的测序及序列分析
• 3 讨论
• 试验二、新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 P29 串联体的构建
• 1.2.2 pCDNA-P29.n（n=2,4,6）的构建
• 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫（LaSota 株）F 基因
• 1.2.4 插入抗原基因
• 1.2.5 新城疫 C3d-P29 分子佐剂 F 基因疫苗效力检测
• 2 结果
• 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建原理
• 2.2 构建P29 串联体
• 2.3 RT-PCR 扩增新城疫La Sota 株F 基因
• 2.4 抗原基因的插入
• 2.5 血凝抑制抗体变化
• 2.6 攻毒保护试验结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间发表论文