论文摘要
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是被广泛研究和应用的昆虫病原真菌之一,然而在实际应用中,杀虫效果受各种胁迫因素的制约,其中活性氧自由基造成的损伤对真菌侵染效果有显著影响。为了抵抗氧化胁迫逆境,昆虫病原真菌具有生物体中普遍存在的超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutlthione perolidlse,GPX）等抗氧化酶以及具有自由基清除活性的小分子代谢物,组成一个完整的抗氧化系统对氧化胁迫作出应激响应,共同抵抗活性氧自由基的损伤。本论文以球孢白僵菌为研究对象,利用不同类型的自由基试剂氧的化胁迫作用,在不同方面和层次上考察了氧化胁迫对球孢白僵菌菌株的生长和细胞形态的影响;综合研究了在胁迫状态下相关抗氧化酶活性和转录水平上的动态变化过程;基于代谢组学分析方法,研究了在H2O2胁迫处理下的球孢白僵菌菌丝体代谢物差异。从细胞形态结构变化、抗氧化酶活性的变化上,以及酶蛋白合成的转录水平差异和代谢物的调整等多方面,对氧化应激所表现出的多种生物学效应和相关作用机制进行了探讨。具体研究内容包括以下几个方面:以SOD酶活性为指标和清除DPPH自由基能力为指标,对不同来源的球孢白僵菌菌株进行了抗氧化能力评价,结果显示不同菌株总SOD酶活水平差异显著,对DPPH清除能力大小不等,清除效率存在显著差异。以球孢白僵菌Bb202为研究对象,利用两种类型的自由基试剂H2O2及亚硝基二磺酸钾（K2NO（SO3）2）,考察了在不同浓度活性氧自由基胁迫下,对球孢白僵菌菌株生长、细胞形态以及细胞的生理生化指标的影响。实验结果表明:在胁迫处理后12h,不同浓度的H2O2和K2NO（SO3）2都不利于细胞的生长,浓度为1mmol/L和2mmol/L的H2O2对菌体生长影响较小,但能够促进胞内SOD酶活性的提高。较高浓度的H2O2胁迫对菌体生长的影响显著,并且胞内SOD酶活性有较大下降。在低浓度的K2NO（SO3）2胁迫下,菌株生物量与对照相比差异不显著,但SOD酶活性变化较为显著,SOD酶活明显高于对照。较高浓度的K2NO（SO3）2同样抑制了细胞的生长和酶活力。显微观察分析表明,不同浓度H2O2胁迫处理下,菌丝体细胞均有损伤,形态差异显著,高浓度的H2O2会造成菌丝提前进入衰老状态。实验浓度下的K2NO（SO3）2胁迫对菌丝细胞的影响相对温和,损伤效应相比H2O2时间滞后,菌体受损的程度低于H2O2的胁迫。外源性和内源性的活性氧胁迫下,球孢白僵菌细胞三种抗氧化酶活性有较大的差异,并且对于氧化胁迫的应激响应程度也不同。在外源性的H2O2胁迫下,能迅速引起胞内CAT的酶活性的升高（胁迫12h）,相对酶活与对照相比提高了136.5%,差异显著。同样也刺激了GPX酶活性的升高,其酶活在胁迫处理24h时达到最高,相对酶活为对照组的112%,SOD活性虽然在胁迫处理24 h时达到最大,但在开始时较低（胁迫1h）,只有对照组的81.9%。K2NO（SO3）地较为强烈地促进了三种抗氧化酶活性的升高,细胞响应比较迅速,在胁迫处理后12h时,SOD酶活为对照组的123.8%,CAT和GPX分别为对照的125.9%和126.4%,但GPX所表现的应急响应程度高于CAT,而CAT酶活是伴随着胞内SOD活性升高的,二者酶活升高的时间基本保持同步。实时荧光定量PCR技术研究表明,H2O2和K2NO（SO3）2胁迫对三种抗氧化酶mRNA表达量均有显著影响,对于外源H2O2的胁迫,CAT mRNA的转录水平表现的最为积极,胁迫后1h和12h时,mRNA转录水平相比同时段的对照组上调了1.57和3.72倍;SOD和GPX的响应程度稍低于CAT,H2O2胁迫后1h时,Cu/Zn-SOD和GPX的mRNA相对表达量变化不大,在胁迫后12h时Cu/Zn-SOD和GPX的mRNA转录水平比同时段对照组上调了5.4倍和2.88倍。在K2NO（SO3）2胁迫处理下,Cu/Zn-SOD、GPX和CAT转录水平均能迅速上调,在胁迫1h时,mRNA转录水平分别为同时段的对照1.49倍、2.8倍和2.41倍在胁迫处理12h时的Cu/Zn-SOD和CAT mRNA的转录水平,相比同时段的对照组上调了2.5倍和2.4倍。H2O2胁迫处理下,不同培养时间的球孢白僵菌菌丝体醇提取物,DPPH和羟基自由基清除率都有明显差异,在胁迫12h-36h时间范围内,其菌丝体提取物对羟基自由基清除率均显著高于对照组,而对DPPH抑制率只在胁迫处理后36h时显著高于对照,为49.6%。表明外源自由基胁迫可激发内源抗氧化或清除自由基的代谢物产生。不同时间段的菌丝体GSH含量变化较大,但普遍低于对照组。K2NO（SO3）2造成的胁迫引起球孢白僵菌丝体中GSH含量的增加。在H2O2胁迫后1h至24h,球孢白僵菌丝体中MDA含量均高于同时间对照组,其中在12h时,其含量与对照相比具有显著性差异。H2O2胁迫对球孢白僵菌丝体生物膜有较大损伤,膜损伤可能是白僵菌在实际生产应用中活力下降的重要原因之一。VC/Fe SO4模型和NADH模型体系都能引起球孢白僵菌线粒体的脂质过氧化,一定浓度范围的谷胱甘肽具有较好的抗线粒体脂质过氧化作用。应用高分辨液质联用并结合多变量统计分析的代谢组学方法,分析了在H2O2胁迫处理下的球孢白僵菌菌丝体代谢物变化。通过PLS-DA的分析结果表明,氧化胁迫明显影响了球孢白僵菌的代谢,多变量分析和聚类分析结果显示,在氧化胁迫处理下,球孢白僵菌菌丝体代谢物与正常生长的菌株存在显著差异,通过谱库检索等方法分别准确定性了43种差异代谢物。进一步通过对氧化胁迫下球孢白僵菌菌丝体代谢物聚类分析,发现处理组和对照组明显分开,相关差异代谢物各自聚为一类。聚类分析结果进一步证实了H2O2胁迫组和对照组具有明显代谢差异。这些差异标志物有可能作为菌体受氧化胁迫的检测依据。
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中文摘要Abstract主要缩略词和符号表第一章 文献综述1 真菌杀虫剂的特点和状况2 影响昆虫病原真菌致病性的因素3 活性氧的种类与微生物的氧化应激3.1 活性氧的种类及来源3.2 活性氧对生物体的氧化损伤作用3.3 氧化应激对昆虫病原真菌的影响及其应对措施4 国内外研究水平及进展4.1 活性氧化胁迫下微生物细胞的应激响应研究进展4.2 活性氧与微生物细胞抗氧化酶合成的关系4.3 真菌来源的次生抗氧化活性物质4.4 代谢组学在微生物代谢物研究中的应用第二章 引言第三章 氧化胁迫对球孢白僵菌生理及抗氧化酶活性的影响第一节 不同菌株抗氧化能力评价及氧化胁迫对其生理生化功能的影响1 材料和方法1.1 实验材料1.2 实验方法2 结果与分析2.1 球孢白僵菌不同菌株SOD酶活力2.2 球孢白僵菌不同菌株对DPPH自由基清除率2O2胁迫下对细胞生长的影响'>2.3 不同浓度H2O2胁迫下对细胞生长的影响2O2胁迫下对SOD活性的影响'>2.4 不同浓度H2O2胁迫下对SOD活性的影响2NO（SO3）2 胁迫下对细胞生长的影响'>2.5 不同浓度的K2NO（SO3）2胁迫下对细胞生长的影响2NO（SO3）2 胁迫下对SOD活性的影响'>2.6 不同浓度的K2NO（SO3）2胁迫下对SOD活性的影响2.7 显微观察及相关分析3 讨论第二节 活性氧胁迫下球孢白僵菌抗氧化酶的应激响应1 材料和方法1.1 实验材料1.2 实验方法2 结果与分析2O2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体SOD酶活性的影响'>2.1 H2O2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体SOD酶活性的影响2O2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体CAT酶活性的影响'>2.2 H2O2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体CAT酶活性的影响2O2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体GPX酶活性的影响'>2.3 H2O2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体GPX酶活性的影响2NO（SO3）2 胁迫下对球孢白僵菌菌丝体SOD酶活性的影响'>2.4 K2NO（SO3）2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体SOD酶活性的影响2NO（SO3）2 胁迫下对球孢白僵菌菌丝体CAT酶活性的影响'>2.5 K2NO（SO3）2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体CAT酶活性的影响2NO（SO3）2 胁迫下对球孢白僵菌菌丝体GPX酶活性的影响'>2.6 K2NO（SO3）2胁迫下对球孢白僵菌菌丝体GPX酶活性的影响2O2胁迫下不同时间的菌丝体SOD粗酶液的NBT活性染色'>2.7 H2O2胁迫下不同时间的菌丝体SOD粗酶液的NBT活性染色2O2胁迫下不同时间的菌丝体CAT粗酶液的NBT活性染色'>2.8 H2O2胁迫下不同时间的菌丝体CAT粗酶液的NBT活性染色3 讨论第四章 氧化胁迫下球孢白僵菌Cu/Zn-SOD、CAT及GPX mRNA转录表达差异分析第一节 球孢白僵菌CAT及GPX基因的部分序列克隆1 材料和方法1.1 实验材料1.2 实验方法2 结果与分析2.1 RNA的提取效果分析2.2 阳性克隆的菌落PCR验证2.3 测序与分析第二节 球孢白僵菌Cu/Zn-SOD、CAT及GPX Realtime-PCR差异表达分析1 材料和方法1.1 实验材料1.2 实验方法2 结果与分析2.1 不同类型氧化胁迫处理菌丝体RNA的提取效果分析2O2胁迫处理下球孢白僵菌的Cu/Zn-SOD mRNA表达量检测'>2.2 H2O2胁迫处理下球孢白僵菌的Cu/Zn-SOD mRNA表达量检测2O2胁迫处理下球孢白僵菌的CAT mRNA表达量检测'>2.3 H2O2胁迫处理下球孢白僵菌的CAT mRNA表达量检测2O2胁迫处理下球孢白僵菌的GPX mRNA表达量检测'>2.4 H2O2胁迫处理下球孢白僵菌的GPX mRNA表达量检测2NO（SO3）2 胁迫下球孢白僵菌的Cu/Zn-SOD mRNA表达量检测'>2.5 K2NO（SO3）2 胁迫下球孢白僵菌的Cu/Zn-SOD mRNA表达量检测2NO（SO3）2 胁迫处理下球孢白僵菌的CAT mRNA表达量检测'>2.6 K2NO（SO3）2 胁迫处理下球孢白僵菌的CAT mRNA表达量检测2NO（SO3）2 胁迫处理下球孢白僵菌的GPX mRNA表达量检测'>2.7 K2NO（SO3）2 胁迫处理下球孢白僵菌的GPX mRNA表达量检测第三节 讨论第五章 球孢白僵菌小分子自由基清除剂抗氧化活性及线粒体脂质过氧化模型的研究第一节 球孢白僵菌小分子自由基清除剂抗自由基损伤的研究1 材料和方法1.1 材料1.2 实验方法2 结果与分析2.1 羟基苯甲酸和熊果苷对昆虫血淋巴的黑化反应2.2 虫生真菌小分子自由基清除剂及其类似物对昆虫血淋巴的形态的影响2O2胁迫处理下球孢白僵菌菌丝体DPPH清除率'>2.3 H2O2胁迫处理下球孢白僵菌菌丝体DPPH清除率2O2胁迫处理下球孢白僵菌菌丝体羟基自由基清除率'>2.4 H2O2胁迫处理下球孢白僵菌菌丝体羟基自由基清除率2O2胁迫对菌丝体甘露醇含量的影响'>2.5 H2O2胁迫对菌丝体甘露醇含量的影响2O2胁迫对发酵液甘露醇含量的影响'>2.6 H2O2胁迫对发酵液甘露醇含量的影响2O2胁迫下的对球孢白僵菌菌丝体GSH含量的影响'>2.7 H2O2胁迫下的对球孢白僵菌菌丝体GSH含量的影响2NO（SO3）2 胁迫对球孢白僵菌丝体中GSH含量的影响'>2.8 K2NO（SO3）2胁迫对球孢白僵菌丝体中GSH含量的影响2O2胁迫对球孢白僵菌丝体MDA的影响'>2.9 H2O2胁迫对球孢白僵菌丝体MDA的影响3 讨论第二节 球孢白僵菌线粒体脂质过氧化模型的建立及GSH对其氧化损伤的保护作用1 材料和方法1.1 材料1.2 实验方法2 结果分析2.1 球孢白僵菌线粒体显微照片4诱导下球孢白僵菌线粒体损伤的保护作用'>2.2 GSH对VC/FeSO4诱导下球孢白僵菌线粒体损伤的保护作用4诱导下的球孢白僵菌线粒体脂质过氧化的影响'>2.3 GSH对VC/FeSO4诱导下的球孢白僵菌线粒体脂质过氧化的影响2.4 GSH对NADH诱导的球孢白僵菌线粒体损伤的保护作用2.5 GSH对NADH诱导下的球孢白僵菌线粒体脂质过氧化的影响3 讨论第六章 氧化胁迫下球孢白僵菌代谢组差异研究1 材料和方法1.1 材料1.2 实验方法2 结果与分析2.1 氧化胁迫下的球孢白僵菌菌丝体代谢物主成分分析2.2 氧化胁迫下球孢白僵菌菌丝体代谢物分析2.3 氧化胁迫下球孢白僵菌菌丝体代谢物聚类分析2.4 代谢途径3 讨论第七章 结论第八章 创新点参考文献致谢个人简介在读期间发表的学术论文
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