黄芩体内H2O2清除系统和黄酮类活性成分积累的相关性及农杆菌介导DHAR基因转化黄芩愈伤组织的研究

论文摘要

黄芩苷、黄芩素等黄酮类化合物作为药用植物黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的有效成分，以其抗氧化抗衰老、抗肿瘤、抗HIV等多种药效功能，成为近年来中外研究的热点。本研究以逆境胁迫下黄芩体内ROS代谢和有效成分积累机制的相互关联为切入点，以黄芩愈伤组织为研究载体，利用植物生理学、分子生物学等手段分析环境因子对黄芩中黄酮积累机制、活性氧代谢水平的影响，深入研究黄芩在温度、水分、光照、等逆境压力下，其体内过氧化氢清除系统和黄酮类积累机制的相关性，旨在阐释道地药材的抗逆机制和有效成分的积累机制之间的相关性；同时，利用现代基因工程技术，构建了DHAR基因植物表达载体，利用农杆菌介导法将外源脱氢抗坏血酸还原酶基因DHAR成功转入黄芩愈伤组织，以期提高活性氧清除酶活性，进而提高黄芩抗氧化胁迫的能力和药用黄芩品质。研究成果如下：（1）40℃高温、黑暗、PEG模拟水分胁迫下总黄酮含量在胁迫后12天显著升高，同时黄酮类生物合成关键酶PAL酶活性也在12天显著升高，表明适度的高温、光照和水分胁迫能够有效促进黄芩总黄酮的积累，且其积累与黄酮类生物合成关键酶PAL酶活性呈正相关（r=0.830）。与之对比，在喷施外源植物生长素极性运输抑制剂后，NPA+40℃、NPA+黑暗、NPA+PEG组总黄酮积累受到抑制，同时PAL酶活性也受到抑制，说明外源NPA在不同条件下均可抑制黄芩悬浮细胞中总黄酮的生物合成及其含量的积累。（2）NPA、NPA+40℃、40℃、NPA+黑暗、黑暗、PEG胁迫12天黄芩苷呈下降趋势，而黄芩素呈上升趋势，同时POD酶活性在10到12天显著升高。相关性分析表明，高温、光照、水分胁迫下黄芩素的积累与过氧化物酶POD的活性呈正相关（r=0.818），说明黄芩有效成分变化对POD活性以及过氧化氢清除系统均会产生影响。（3）NPA、NPA+40℃、40℃、NPA+黑暗、黑暗、PEG胁迫12d前后黄芩苷呈下降趋势，黄芩素呈上升趋势，POD酶活性呈升高趋势，H2O2含量保持稳定，表明适度的环境胁迫促进黄芩总黄酮的积累，黄芩苷在POD酶的作用下转化为黄芩素，同时维持H2O2水平的稳定以避免氧化伤害。（4）成功构建了脱氢抗坏血酸还原酶基因DHAR植物双元表达载体pCAMBIA1305-DHAR，并将其导入农杆菌EHA105中。（5）以根癌农杆EHA105介导将DHAR导入黄芩愈伤组织，以潮霉素（Hgy）的抗性植株和PCR呈阳性的植株作为转化植株的初步判定，成功建立了农杆菌介导DHAR基因转化黄芩愈伤组织体系。本研究结果为阐明黄芩H2O2清除系统和黄酮类活性成分积累的相关性以及道地药材的品质形成具有一定的理论意义，为进一步以基因工程方法研究并提高黄芩的抗氧化胁迫的能力，选育高抗逆性的新品种奠定基础。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 黄芩简介及其研究进展

1.1.1 黄芩简介

1.1.2 黄芩应用前景及研究进展

1.2 黄芩药理作用

1.2.1 清楚自由基及抗氧化

1.2.2 抗菌、抗病毒

1.2.3 抗肿瘤

1.2.4 抗炎、抗变态反应

1.3 活性氧代谢对黄芩有效成分积累机制的影响

1.3.1 活性氧简介

1.3.2 活性氧的产生机制

1.3.3 活性氧的清除机制

1.3.4 活性氧的信号传导

1.4 黄酮类化合物生物合成及调控机制

1.4.1 黄酮类化合物生物合成机制

1.4.2 黄酮类化合物合成调控机制

1.5 黄酮类化合物抗氧化机制

1.6 生物技术在药用黄芩中的研究进展

1.7 植物抗坏血酸和脱氢抗坏血酸还原酶的研究进展

1.7.1 植物抗坏血酸简介

1.7.2 植物抗坏血酸的抗氧化机理

1.7.3 植物脱氢抗坏血酸还原酶研究进展

1.8 本实验的目的和意义

第二章 H2O2清除系统和黄酮类活性成分积累的相关性研究

2.1 材料和方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 仪器和试剂

2.1.3 分析方法

2.2 结果与分析

2.2.1 外源 NPA 对黄芩有效成分积累与 H2O2清除系统的影响

2.2.2 高温对黄芩有效成分积累与 H2O2清除系统的影响

2.2.3 光照对黄芩有效成分积累与 H2O2清除系统的影响

2.2.4 PEG 模拟水分胁迫对黄酮类积累与 H2O2清除系统的影响

2.3 小结与讨论

2.3.1 环境变化对黄芩有效成分的影响

2.3.2 黄芩有效成分变化对过氧化物酶活性的影响

2.3.3 黄酮氧化过程在不同环境条件下表现存在差异

第三章脱氢抗坏血酸还原酶基因植物表达载体的构建

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 DHAR 基因植物表达载体的构建

3.2 结果与分析

3.2.1 目的基因的获得

3.2.2 阳性克隆的筛选和鉴定

3.2.3 表达载体的鉴定

3.3 小结与讨论

第四章农杆菌 EHA105 介导 DHAR 基因转化黄芩愈伤组织

4.1 材料与方法

4.1.1 植物材料

4.1.2 材料与试剂

4.1.3 培养基成分

4.1.4 实验内容与方法

4.2 结果与分析

4.2.1 农杆菌转化子 pCAMBIA1305-DHAR-EHA105 的 PCR 鉴定

4.2.2 不同侵染时间和菌液浓度对转化效率的影响

4.2.3 潮霉素梯度抗性筛选

4.2.4 转化愈伤组织 Hyg 基因的检测

4.2.5 转化愈伤组织目的基因的检测

4.3 小结与讨论

第五章总结和展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间的研究成果

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