Beclin 1沉默对维生素K3诱导的人肝癌细胞损伤的影响

论文摘要

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率有上升的趋势。因此,深入研究肝癌的分子机制,从分子水平和基因水平上发展出更有效的治疗手段越来越受到重视。本研究探讨不同浓度VK3对人肝癌细胞SMMC-7721损伤影响,以及Bcl-2和Bax表达的变化。利用RNAi技术,建立自噬基因Beclin 1沉默的人肝癌细胞SMMC-7721模型系统。进一步研究自噬抑制对VK3诱导的人肝癌细胞SMMC-7721损伤的影响以及在此过程中自噬和凋亡的关系。研究结果表明:VK3能够诱导人肝癌SMMC-7721细胞损伤,并呈剂量相关性。机制可能与下调Bcl-2、上调Bax mRNA和蛋白表达有关;利用RNAi技术成功构建pSH1Si-Beclin 1表达载体,转染人肝癌SMMC-7721细胞后,可显著抑制Beclin1 mRNA和蛋白表达;RNAi沉默Beclin1表达以及应用自噬特异性抑制剂3-MA,显著降低人肝癌SMMC-7721细胞自噬能力,促进VK3诱导的SMMC-7721细胞凋亡,提示自噬在VK3诱导人肝癌细胞SMMC-7721损伤中很可能是一种细胞的自我保护机制。这一实验结果对探讨Beclin 1在肝癌发病过程中所发挥的作用进行了新的探索,也为寻找肝癌基因治疗新的作用靶点进行了有益的尝试,细胞通过自噬提供能量促进细胞生存,能在一定程度上拮抗氧化应激造成的细胞损伤,从而推测肝癌治疗中利用自噬抑制结合抗癌药物的方法很可能是一种新的治疗手段。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词表
• 前言
• 第1章 文献综述
• 1.1 细胞死亡的概述
• 1.2 自噬性细胞程序性死亡研究进展
• 1.2.1 自噬的形态学特点及分类
• 1.2.2 自噬发生过程的分子机制
• 1.2.3 自噬过程的信号调控
• 1.3 自噬与凋亡的关系
• 1.3.1 凋亡概述
• 1.3.2 凋亡的多重机制
• 1.3.3 自噬与凋亡
• 1.3.4 维生素K3 与细胞损伤
• 1.4 自噬在生理和病理过程中的作用
• 1.4.1 生理过程中的自噬
• 1.4.2 病理过程中的自噬
• 1.5 自噬的监测与研究方法
• 1.5.1 形态学方法
• 1.5.2 自噬的特异标志物和抑制剂
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 细胞株
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.1.6 Western blot 相关试剂
• 2.2 实验方法
• TM 3.1-H1 neo-Beclin 1 siRNA 载体构建'>2.2.1 pSilencer^TM 3.1-H1 neo-Beclin 1 siRNA 载体构建
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 重组质粒转染及沉默效应检测
• 2.2.4 细胞生长抑制试验MTT 法
• 2.2.5 RT-PCR 半定量分析
• 2.2.6 Western blot 分析蛋白表达
• 2.2.7 流式细胞术（FCM）PI 染色法检测细胞凋亡率
• 2.2.8 MDC 染色检测自噬
• 2.2.9 Hoechst 33342 染色检测细胞凋亡
• 2.2.10 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 维生素K3 诱导人肝癌细胞SMMC-7721 损伤的作用
• 3 对SMMC-7721 细胞增殖的影响'>3.1.1 不同浓度VK₃ 对SMMC-7721 细胞增殖的影响
• 3.1.2 RT-PCR 检测SMMC-7721 细胞Bcl-2 及Bax m RNA 表达
• 3.1.3 Western blot 检测SMMC-7721 细胞Bcl-2 及Bax 蛋白表达
• TM 3.1-H1 neo-Beclin 1 siRNA 表达载体的构建及其沉默效应'>3.2 pSilencer^TM 3.1-H1 neo-Beclin 1 siRNA 表达载体的构建及其沉默效应
• 3.2.1 pSH1Si-Beclin 1 表达载体的构建
• 3.2.2 pSH1Si-Beclin 1 表达质粒转染及筛选
• 3.2.3 PCR 检测 pSH1Si-Beclin 1 质粒转染后 Beclin 1 mRNA 的表达
• 3.2.4 Western blot 检测 pSH1Si-Beclin 1 质粒转染后 Beclin 1 蛋白表达
• 3 诱导的SMMC-7721 细胞损伤的影响'>3.3 Beclin 1 沉默对维生素K₃ 诱导的SMMC-7721 细胞损伤的影响
• 3 诱导细胞损伤中Beclin 1 m RNA 表达的变化'>3.3.1 PCR 检测VK₃ 诱导细胞损伤中Beclin 1 m RNA 表达的变化
• 3.3.2 MDC 染色检测细胞自噬活性变化
• 3.3.3 Hoechst 33342 染色检测细胞凋亡
• 3.3.4 FCM 检测PI 染色细胞凋亡率
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的文章
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract