镉—菲复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）和白线蚓（Fridericia bulbosa）的生态毒理效应研究

论文摘要

土壤是环境的重要组成部分,承担着环境中大约90%的来自各方面的污染物质,是一个典型的复合污染体系。近年来,国内外已相继开展了重金属-重金属以及有机-有机复合污染方面的研究工作,并取得了富有成效的理论和实践成果。但是,对于有机污染物-重金属复合污染的研究相对较少,对其定量表征及分子生态毒理效应的研究则更少。事实上,土壤中有机污染物-重金属复合污染非常普遍。其中,多环芳烃、重金属是经常共存、广泛分布的典型土壤环境污染物。开展有机污染物-重金属复合污染研究,对于正确评价复合污染条件下污染物迁移转化的行为,帮助人们采取合理的诊治措施,解决土壤的环境污染问题具有非常重要的理论和实践意义。作为土壤动物区系的代表类群——安德爱胜蚓（Eisenia andrei）和白线蚓（Fridericia bulbosa）,已日益成为生态毒理学研究的载体。目前,国内外学者对蚯蚓的生态毒理学进行了大量的研究,其中农药、重金属单一及复合污染较多,但关于多环芳烃及其复合污染对蚯蚓的生态毒理的研究相对较少。本文采用室内模拟方法,开展了典型重金属（Cd）-典型多环芳烃（Phe）复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）和白线蚓（Fridericia bulbosa）的生态毒理研究,在此基础上,对Cd-Phe复合污染生态毒理生物标志物的筛选和定量表征进行了重点而深入的研究,以期为有机污染物-重金属复合污染研究与诊治提供科学依据和实践指导,主要研究结果如下:1.从个体水平,分别采用人工土壤法和自然土壤法,研究Cd、Phe单一及复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）和白线蚓（Fridericia bulbosa）的急性毒性。结果表明:安德爱胜蚓（Eisenia andrei）对Cd污染的耐受能力强;Phe对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）的急性毒性高。Cd-Phe复合污染对Eisenia andrei的急性毒性效应中Phe为主效应。重金属Cd和Phe之间存在明显的交互作用,Cd-Phe复合污染产生的拮抗作用及其强度与Cd和Phe的不同浓度组合密切相关。这两种污染物对白线蚓（Fridericia bulbosa）都具有潜在的毒性效应,毒性大小顺序为Phe大于Cd;Cd、Phe染毒14d的理论LC50分别为4.548 mg kg-1、4.482mg kg-1。染毒14d后,当Phe的染毒剂量为0.1 mg kg-1和1.6 mg kg-1时,Cd-Phe复合污染对白线蚓的急性毒性效应为协同作用,当Phe的染毒剂量25.6 mg kg-1时,Cd-Phe复合污染对白线蚓的急性毒性效应为拮抗作用,复合污染物的组成及各污染物的不同浓度组合是决定两者之间的交互作用类型和毒性的重要因素。Cd-Phe复合污染对白线蚓（Fridericia bulbosa）的急性毒性效应中Cd为主效应因子。白线蚓（Fridericia bulbosa）是一种可用于表征Cd-Phe复合污染效应的指示生物。2.从组织水平,采用人工土壤法,研究Cd、Phe单一及不同浓度组合复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）抗氧化物酶系:过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性的影响,结果表明:Cd、Phe单一污染,CAT活力最微弱,各处理组GSH-PX活性与对照组的差异最为显著; CAT活性变化趋势极不稳定,SOD、GSH-PX活性则均具有先升高后降低的趋势;其中复合污染较单一污染对SOD活性表现出较强的抑制作用;而复合污染较单一污染对GSH-PX活性则表现诱导激活作用。GSH-PX可作为Cd、Phe单一及不同浓度组合复合污染的生物标志物,其活性变化可作为表征Cd-Phe复合污染的一项重要的参考指标。3.从细胞和亚细胞水平,优化了蚯蚓体腔细胞提取方法。采用纤维针法与超声波刺激法结合的方法提取的单位体重细胞数较多且存活率较高,为后期的细胞形态学和细胞内DNA损伤的实验打下了基础。采用自然土壤染毒法,研究Cd、Phe单一及复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体腔细胞溶酶体膜中性红保持时间（NRRT）的影响,并采用细胞流式技术（FCM）研究Cd、Phe单一及复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体腔细胞质膜的损伤作用,探讨Cd和Phe的跨膜毒理机制。结果表明: NRRT与Cd污染浓度和染毒时间存明显的剂量-效应关系。随染毒时间延长,Cd与Phe复合污染对蚯蚓体腔细胞毒性逐渐增加,蚯蚓染毒7d后和染毒14d后,Cd与Phe复合污染对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜损伤的交互作用表现为协同作用;Cd是影响Cd-Phe复合污染对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜NRRT影响的主效应因子。NRRT是表征Cd-Phe复合污染毒性的灵敏、准确、重复性好的生物标志物。此外,安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体腔细胞在受到Cd、Phe单一及复合污染胁迫下的早期凋亡率可作为污染物毒性评价的敏感指标,可用于对污染物毒性的早期预警。利用细胞流式技术对Cd-Phe复合污染胁迫下蚯蚓体腔细胞的类群的研究,是评价Cd-Phe单一及复合污染及其污染修复程度的一种合理可行的实验方法。4.从分子水平,采用自然土壤法,用单细胞凝胶电泳技术（SCGE）研究Cd、Phe单一及复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体腔细胞DNA损伤作用。结果显示: Cd、Phe单一污染均表现出致蚯蚓体腔细胞DNA损伤作用,Cd、Phe单一污染与蚯蚓体腔细胞DNA损伤存在明显的剂量-效应关系;Cd-Phe复合污染对蚯蚓细胞DNA的损伤远大与单一的Cd或Phe的污染,单一Cd污染下蚯蚓细胞的OTM值较低,Cd-Phe复合污染下,随着Phe剂量的增加OTM值不断增大,说明Phe对Cd的毒性有显著的增强作用。染毒14d后,Cd-Phe复合污染对蚯蚓体腔细胞DNA损伤表现为拮抗作用。Cd是Cd-Phe复合污染对蚯蚓体腔细胞DNA损伤的主效应因子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 土壤环境污染
• 1.1.1 土壤环境重金属污染
• 1.1.2 土壤环境多环芳烃污染
• 1.2 土壤环境复合污染
• 1.2.1 复合污染概念与分类
• 1.2.2 复合污染研究方法
• 1.2.3 复合污染定量表征
• 1.2.4 土壤复合污染生态毒理效应的研究现状
• 1.2.5 复合污染研究展望
• 1.3 生态毒理学
• 1.3.1 生态毒理学的学科内涵
• 1.3.2 生态毒理学的形成与发展
• 1.3.3 生态毒理学的研究方法
• 1.4 蚯蚓生态毒理学
• 1.4.1 土壤环境污染指示生物
• 1.4.2 蚯蚓生态毒理学的研究内容
• 1.4.3 蚯蚓生态毒理学的研究方法
• 1.4.4 生物标志物在蚯蚓生态毒理学研究中的应用
• 第二章 研究背景、意义、内容和技术路线
• 2.1 研究背景
• 2.2 研究对象
• 2.2.1 土壤环境中的重金属Cd （Cadmium）
• 2.2.2 土壤环境中的多环芳烃Phe （Phenanthrene）
• 2.3 研究意义
• 2.4 研究内容
• 2.5 技术路线
• 第三章 Cd、Phe 单一与复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）的急性毒性试验
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试动物
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 人工土壤法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Cd、Phe 单一污染对蚯蚓的急性毒性
• 3.3.2 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓的急性毒性
• 3.4 讨论
• 3.4.1 Cd 对生物的毒作用机理
• 3.4.2 Phe 对生物的毒作用机理
• 3.4.3 复合污染作用机理探讨
• 3.4.4 试验结果评价
• 3.4.5 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓的急性毒性的主效应分析
• 3.5 小结
• 第四章 Cd、Phe 单一与复合污染对白线蚓（Fridericia bulbosa）的急性毒性试验
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 供试动物
• 4.1.2 药品与试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 自然土壤法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Cd、Phe 单一污染对白线蚓的急性毒性
• 4.3.2 Cd-Phe 复合污染对白线蚓的急性毒性
• 4.3.3 Cd-Phe 复合污染对白线蚓的急性毒性的主效应分析
• 4.3.4 白线蚓作为指示生物的优越性
• 4.3.5 污染物对白线蚓的毒作用受实验土壤的物理和化学性质影响
• 4.3.6 Cd-Phe 复合污染的互作机制
• 4.4 小结
• 第五章 Cd-Phe 污染胁迫对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体内抗氧化酶系的影响
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 供试动物
• 5.1.2 药品与试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 溶液配制
• 5.2.2 实验设计
• 5.2.3 土壤染毒
• 5.2.4 蚯蚓匀浆液的制备
• 5.2.5 蛋白质含量的测定
• 5.2.6 抗氧化酶活性的测定
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 蛋白质测定的标准曲线
• 5.3.2 Cd 单一污染对蚯蚓体内抗氧化酶活性的影响
• 5.3.3 Phe 单一污染对蚯蚓体内抗氧化酶活性的影响
• 5.3.4 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体内抗氧化酶活性的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 过氧化氢酶（CAT）解毒机理分析
• 5.4.2 超氧化物歧化酶（SOD）解毒机理分析
• 5.4.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）解毒机理分析
• 5.4.4 试验结果分析
• 5.5 小结
• 第六章 安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体腔细胞提取方法的筛选
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 供试动物
• 6.1.2 药品与试剂
• 6.1.3 主要溶液
• 6.1.4 主要仪器
• 6.1.5 实验条件
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 电压刺激法
• 6.2.2 超声波刺激法
• 6.2.3 纤维针法
• 6.2.4 纤维针结合超声波刺激法
• 6.2.5 细胞记数、染色
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 蚯蚓体腔细胞的分类
• 6.3.2 蚯蚓体腔细胞提取方法比较
• 6.4 小结
• 第七章 Cd-Phe 复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）溶酶体膜稳定性的影响
• 7.1 试验材料
• 7.1.1 供试动物
• 7.1.2 药品与试剂
• 7.1.3 主要仪器
• 7.2 试验方法
• 7.2.1 自然土壤法
• 7.2.2 土壤染毒
• 7.2.3 蚯蚓培养
• 7.2.4 中性红保留时间的测定
• 7.2.5 实验结果统计
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 中性红染色后蚯蚓体腔细胞的形态观察
• 7.3.2 Cd 单一污染对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜NRRT 的影响
• 7.3.3 Phe 单一污染对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜NRRT 的影响
• 7.3.4 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜NRRT 的影响
• 7.3.5 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体腔细胞毒性的交互作用
• 7.3.6 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体腔细胞毒性的主效应分析
• 7.3.7 Cd-Phe 复合污染影响蚯蚓溶酶体膜稳定性的机理
• 7.4 小结
• 第八章 Cd-Phe 复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）体腔细胞成活率和凋亡的影响
• 8.1 试验材料
• 8.1.1 供试动物
• 8.1.2 药品与试剂
• 8.1.3 主要仪器
• 8.2 试验方法
• 8.2.1 自然土壤法
• 8.2.2 土壤染毒
• 8.2.3 蚯蚓培养
• 8.2.4 利用流式细胞术检测蚯蚓体腔细胞质膜完整率及凋亡率
• 8.2.5 实验结果统计
• 8.3 结果与分析
• 8.3.1 利用流式细胞术检测蚯蚓体腔细胞质膜完整率及凋亡率
• 8.3.2 Cd、Phe 单一与复合污染对蚯蚓体腔细胞成活及凋亡状况的影响.
• 8.4 小结
• 第九章 Cd-Phe 复合污染对安德爱胜蚓（Eisenia andrei）DNA 的损伤
• 9.1 试验材料
• 9.1.1 供试动物
• 9.1.2 药品与试剂
• 9.1.3 主要仪器
• 9.2 试验方法
• 9.2.1 自然土壤法
• 9.2.2 Cd、Phe 单一污染与蚯蚓体腔细胞DNA 损伤的剂量-效应关系
• 9.2.3 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体腔细胞DNA 的损伤
• 9.2.4 蚯蚓培养
• 9.2.5 蚯蚓体腔细胞的提取
• 9.2.6 制片（双层凝胶法）、裂解及电泳
• 9.2.7 染色及图像采集
• 9.2.8 检测指标及数据处理
• 9.3 结果与分析
• 9.3.1 蚯蚓体腔细胞DNA 受损形态
• 9.3.2 Cd 单一污染对蚯蚓体腔细胞DNA 的损伤
• 9.3.3 Phe 单一污染对蚯蚓体腔细胞DNA 的损伤
• 9.3.4 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体腔细胞DNA 的损伤情况
• 9.3.5 Cd-Phe 复合污染对蚯蚓体腔细胞DNA 损伤毒性的交互作用和主效应分析
• 9.4 小结
• 第十章 总结及展望
• 10.1 全文研究结论
• 10.2 研究结论归纳
• 10.3 创新点
• 10.4 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及奖励