黄曲霉毒素B1致毒中尿素循环关键基因的研究和CPS1的生物学研究

论文摘要

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的的恶性肿瘤之一,探讨肝癌发生发展的分子机制、寻找肝癌早期诊断的生物学标志,这对肝癌早期诊断和治疗具有重要的临床意义。黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是一种强烈的肝癌诱发剂,它是目前应用最广泛的肝癌动物模型诱癌剂之一,被广泛应用于肝癌病因、发病机理、化学预防等方面的研究。本研究用黄曲霉毒素B1感染小鼠,然后利用荧光定量PCR对黄曲霉毒素B1感染后的小鼠肝脏的cps1、otc和sir5基因的mRNA量进行了相对定量。结果发现cps1、otc和sir5基因的mRNA量都发生下调,其中cps1下调这结果与本实验课题组的双向电泳的结果一致。在黄曲霉毒素B1感染小鼠中,动态测定小鼠血氨浓度的变化,发现血氨浓度随着毒素感染时间的推移在上升。PCR法检测到cps1、otc和sir5基因在小鼠脑、心脏、脾脏、肝脏、肾、小肠、睾丸等组织器官都有表达。接着,将cps1、otc和sir5基因构建到原核表达载体转化到E.coli BL21（DE3）宿主菌,通过IPTG诱导阳性菌,成功表达了OTC和SIR5两个蛋白,并纯化这两个蛋白,制备抗原,免疫Bal/c小鼠,ELISA测定血清效价,最后成功制备了OTC和SIR5的多克隆抗体。通过Far western法初步鉴定到OTC与SIR5蛋白互作。最后研究CPS1的细胞生物学功能。首先,构建了cps1的干扰载体,转染肝癌细胞系BEL-7402和肝正常细胞chang liver。在cps1干扰的细胞系中,检测到OTC和SIR5蛋白都发生了下调。MTT法检测黄曲霉毒素B1对不同细胞的半抑制剂量IC50,在此基础上检测到干扰cps1后细胞对黄曲霉毒素B1耐受能力降低。通过荧光定量PCR法检测到被黄曲霉毒素B1感染的正常肝细胞chang liver的cps1基因的mRNA量持续降低。CPS1和OTC都是尿素循环的关键酶,本实验结果提示,黄曲霉毒素B1会干扰尿素循环的正常进行,影响CPS1和OTC的转录水平。同时CPS1可能参与人类肝癌的发生发展过程,提示CPS1可能是肝癌的分子标记物,在肝癌的诊断和预后评估等方面具有潜在的临床应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 前言
• 1.1 黄曲霉毒素及其危害
• 1.2 黄曲霉毒素的致癌机理
• 1.2.1 黄曲霉毒素B1 的代谢过程
• 1.2.2 黄曲霉毒素B1 的基因毒性和致癌性
• 2 尿素循环
• 2.1 尿素循环的关键酶
• 2.1.1 氨甲酰磷酸合成酶
• 2.1.2 鸟氨酸氨甲酰转移酶
• 2.1.3 其他关键酶
• 2.2 尿素循环障碍
• 2.2.1 尿素循环障碍类型和临床表现
• 2.2.1.1 高血氨症Ⅰ型
• 2.2.1.2 高血氨症Ⅱ型
• 2.2.1.3 尿素循环障碍其他类型
• 2.3 尿素循环与肝癌关系
• 3 RNA 干扰技术
• 3.1 RNA 干扰技术在基因功能研究中的应用
• 3.2 RNA 干扰技术在哺乳动物中的应用
• 3.2.1 RNA 干扰与肿瘤基因治疗
• 3.2.2 RNA 干扰与病毒性疾病治疗
• 3.2.3 RNA 干扰在治疗其他疾病方面
• 3.3 RNA 干扰技术在农药研究中的应用
• 4 实时定量PCR 在基因表达分析研究中的应用
• 5 本研究的目的意义
• 第二章 黄曲霉毒素B1 的提取和浓度测定
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 毒素检测试剂盒
• 2 方法
• 2.1 黄曲霉毒素B1
• 2.1.1 黄曲霉毒素B1 标准菌株的培养
• 2.1.2 黄曲霉毒素B1 的提取
• 2.1.3 ELISA 标准曲线法测定黄曲霉毒素B1 的浓度
• 3 结果与分析
• 3.1 黄曲霉毒素菌株的培养
• 3.2 黄曲霉毒素B1 的浓度
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 尿素循环关键基因的变化与分布及其血氨动态变化
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 1.4 黄曲霉毒素B1 粗提液
• 1.5 引物序列
• 2 实验方法
• 2.1 感染老鼠
• 2.2 血氨测定
• 2.3 黄曲霉毒素B1 感染小鼠中体重的测定
• 2.4 小白鼠肝脏RNA 的提取
• 2.5 cDNA 第一链合成
• 2.6 荧光定量PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 小白鼠血氨测定
• 3.1.1 血氨标准曲线的制备
• 3.1.2 血氨浓度的动态变化
• 3.2 小白鼠体重测定
• 3.3 RNA 提取结果
• 3.4 实时荧光定量PCR 结果
• 3.4.1 cps1、otc、gapdh 和si15 基因的扩增曲线
• 3.4.2 cps1、otc、gapdh 和si15 基因的相对定量
• 3.5 cps1、otc 和si15 基因在小鼠各组织的分布情况
• 4 讨论
• 4.1 实时定量PCR 的关键步骤和数据分析
• 4.2 cps1、otc 和si15 基因的表达变化
• 4.3 不同浓度的黄曲霉毒素B1 对小白鼠体重的影响
• 5 结论
• 第四章 cps1、otc 和si15 载体的构建及otc 与si15 蛋白体外互作
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验模式动物
• 1.4 质粒和菌株
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠肝脏RNA 的提取
• 2.2 RT-PCR
• 2.3 基因的扩增
• 2.4 载体的构建
• 2.5 基因的原核表达
• 2.6 蛋白质的大量表达与纯化
• 2.7 蛋白质的浓度测定
• 2.8 多克隆抗体的制备
• 2.9 Far western
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA 提取与RT-PCR
• 3.2 载体的构建
• 3.3 蛋白质的表达与纯化
• 3.4 多克隆抗体制备
• 3.5 蛋白互作分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 第五章 cps1 生物学研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 设计用于干扰的寡核苷酸片段
• 2.2 构建干扰载体
• 2.3 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选和鉴定
• 2.4 细胞总RNA 提取
• 2.5 RT-PCR
• 2.6 实时定量PCR 检测RNA 干扰水平
• 2.7 Western
• 2.8 黄曲霉毒素B1 对细胞cps1 表达的影响
• 2.9 RNA 干扰对细胞的影响
• 2.9.1 MTT 比色法测定细胞增殖活性
• 2.9.2 细胞对黄曲霉毒素B1 的耐受能力
• 3 实验结果与分析
• 3.1 重组子验证
• 3.2 RNA 提取
• 3.3 RNAi 干扰效果
• 3.4 黄曲霉毒素 B1 对细胞 cps1 表达的影响
• 3.5 黄曲霉毒素 B1 对不同细胞的半抑制率测定
• 3.6 干扰 cps1 基因后细胞对黄曲霉毒素 B1 的耐受能力
• 3.7 干扰 cps1 后相关蛋白的表达变化
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢