口腔细菌影响绿脓假单胞菌感染肺上皮细胞的体外研究

论文摘要

目的牙周病是人类最常见的慢性感染性疾病。近年来,许多国内外的专家研究证实牙周感染可能是引发全身系统疾病（如:心血管疾病、糖尿病,呼吸系统疾病、消化道疾病、骨质疏松、低体重早产儿、疱疹病毒感染等）的危险因素[1-8]。牙周病与肺感染的关系也逐渐进入了国内外研究者的视野。Bartlet[9]研究发现35%的院内感染的肺炎与致病的厌氧菌有关。此后大量实验从感染的肺脏中分离出与牙周破坏有关的厌氧菌,从而证实了他的观点。1990年Slots[10]从难治性牙周炎患者口腔分离出绿脓假单胞菌。国内学者何礼贤[11]通过分子生物学技术证实了获得性肺炎的病原菌与口咽部细菌有高度的同源性。上述研究都表明了牙周细菌与肺感染有着密切的关系。绿脓假单胞菌是一种很重要的条件性的细菌性病原体,它可以造成肺部组织和其它全身系统的易感宿主细胞的感染。绿脓假单胞菌的感染可以通过对上皮细胞的粘膜黏附和侵入得以实现。宿主细胞防御的失败以至不能清除粘膜表面的绿脓假单胞菌,造成绿脓假单胞菌在局部的增殖,有时将伴随着明显的感染和组织细胞的大量破坏。本研究通过建立口腔细菌侵入和感染肺上皮细胞的体外模型,研究口腔细菌在绿脓假单胞菌侵入肺上皮细胞时的调节机制。目前被确认的牙周可疑致病菌主要包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,Fn）、伴放线菌聚集菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa）可以显著增加绿脓假单胞菌进入肺上皮细胞细菌的数量。然而,不属于牙周可疑致病菌的口腔内源共生细菌如内氏放线菌（Actinomyces naeslundii,An）和格氏链球菌（Streptococcus gordonii,Sg）显示在绿脓假单胞菌侵入肺上皮细胞时没有明显促进感染的作用。当绿脓假单胞菌和口腔细菌同时侵入与绿脓假单胞菌单独侵入肺上皮细胞相比,前者将刺激肺上皮细胞产生更多的炎症细胞因子。在口腔的感染细菌中,牙龈卟啉单胞菌为慢性牙周炎的主要致病菌,在本研究中牙龈卟啉单胞菌与绿脓假单胞菌共同作用于肺上皮细胞产生炎症细胞因子IL-6和IL-8,IL-6激活了JAK-STAT3的信号传导途径。STAT3靶基因产物包括影响细胞凋亡的Bcl-2家族成员和IAP家族中的Survivin抑凋亡蛋白。当牙龈卟啉单胞菌细菌的浓度达到一定量的时候,促进凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白,在不同时间点的mRNA水平发生改变,以此推断出牙龈卟啉单胞菌在短时间黏附、内化于肺上皮细胞,并在细胞内增殖,与绿脓假单胞菌共同作用更进一步的促进肺上皮细胞的凋亡,进而导致肺部组织炎症破坏加重。本研究的目的是研究当口腔细菌与绿脓假单胞菌共同作用于肺上皮细胞,细菌侵入宿主细胞数量的变化,诱导宿主细胞凋亡的程度,阐明这种反应的凋亡通路及其细胞所释放的细胞因子在反应过程中的动态变化,探讨牙周致病菌在导致肺部感染中的协同作用和作用机制。方法一、研究对象呼吸道细菌:绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginnosa Pa,ATCC BAA-47PAO1模式株。）口腔细菌:①牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis Pg,381模式株）②具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum Fn,ATCC 25586模式株）③伴放线菌聚集菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans Aa,ATCC 43717模式株）④内氏放线菌（Actinomyces naeslundii An,PK606模式株）⑤格氏链球菌（Streptococcus gordonii Sg,Chalis CH1模式株）呼吸道上皮细胞:HEp-2细胞株（人喉表皮癌细胞株）A549细胞株（人肺腺癌细胞株）二、研究方法1、细菌黏附与侵入实验包括细菌和肺上皮细胞的体外培养,细菌浓度的选择与作用时间的选择,绿脓假单胞菌单独或和其它细菌共同黏附和侵入肺上皮细胞时细菌与细胞的数量变化。2、细胞的存活及凋亡细胞的检测（1）MMT法检测细菌感染细胞后,不同时间段的肺上皮细胞的活细胞数。（2）荧光分光光度计分析AMC荧光强度的大小,测定细胞凋亡蛋白（caspase-3）的活性,反映细胞凋亡的程度。3、细胞因子的检测:应用酶标记免疫吸附实验方法（ELISA）检测口腔细菌对PAO1菌株感染后肺上皮细胞产生IL-6和IL-8的变化。4、凋亡蛋白和信号传导通路蛋白表达从分子水平观察牙龈卟啉单胞菌P.gingivalis 381菌株与绿假单胞菌PAO1细胞株致肺细胞凋亡的通路及其参与上述过程的细胞因子,选用RT-PCR和Realtime-PCR研究方法三、统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计学分析。对于数据呈正态分布时,均数用mean±SD表示,两组比较采用独立样本t检验或方差分析。数据呈非正态分布时,均数用中位数表示,组间比较时应用秩和检验。计数资料比较使用X2检验。运用Logistic回归模型进行多因素分析。以p<0.05为有显著差异。结果一、口腔细菌对绿脓假单胞菌侵入肺上皮细胞的调节绿脓假单胞菌单独或和其它口腔细菌共同黏附和侵入肺上皮细胞,当口腔细菌存在的情况下,PAO1与上皮细胞培养时,其黏附于肺上皮细胞的程度随着所共同培养口腔细菌的种类不同而变化。与F.nucleatum、S.gordonii或A.naeslundii共同培养并没有明显改变PAO1对肺上皮细胞的黏附能力。相反,与P.gingivalis和A.actinomycetemcomitans共同培养均明显减少了PAO1对上皮细胞的黏附。对细菌侵入上皮细胞的研究显示,P.gingivalis、F.nucleatum和A.actinomycetemcomitans明显增加了侵入上皮细胞内的PAO1的百分率,是PAO1单独培养的3倍,而A.naeslundii和S.gordonii对PAO1侵入细胞的能力没有明显影响。二、绿脓假单胞菌对口腔细菌侵入肺上皮细胞的调节1、上皮细胞的存活MTT实验检测结果显示:当肺上皮细胞与PAO1单独孵育或PAO1及口腔细菌（MOI 100:1）共同孵育时,在1小时后存活的上皮细胞数目轻度减少。与PAO1单独孵育相比,当PAO1与口腔细菌共存时,在所有研究时点都有更多的上皮细胞被杀伤。对所有检测的菌株来说,大多数细胞在培养<6小时仍是存活的。但是培养12小时时,大多数情况下上皮细胞的死亡都是增加的。而且与PAO1单独培养（平均55%上皮细胞仍存活）相比,当A.actinomycetemcomitans与PAO1、F.nucleatum与PAO1、S.gordonii与PAO1共同孵育时,存活的上皮细胞数目减少的更加明显,分别为32%（p<0.001）、39%（P<0.01）和41%（P<0.01）。P.gingivalis与PAO1共同孵育时,受损的上皮细胞数目仅有50%细胞存活,也较PAO1单独暴露时增多,但差异未达到统计学显著性。本研究还检测了每种口腔细菌单独孵育对肺上皮细胞存活的影响作为对照。结果显示口腔细菌S.gordonii、A.actinomycetemcomitans、A.naeslundii单独侵入引起肺上皮细胞受损通常发生在感染12小时以后。此时的细胞存活率分别为48%、52%和65%。而P.gingivalis和F.nucleatum单独侵入12小时并没有引起上皮细胞明显受损。2、上皮细胞的凋亡细胞凋亡蛋白酶（Caspase-3）活性增加是真核细胞凋亡的标志。无论PAO1单独感染宿主细胞还是其与口腔细菌共同孵育后,肺上皮的凋亡均被启动。PAO1诱导的上皮细胞凋亡随着时间延长而增加,与口腔细菌的共同侵入能进一步促进细胞的凋亡。与PAO1单独侵入相比,在培养1小时后,仅是P.gingivalis与PAO1的共同侵入使肺上皮细胞的凋亡明显增加（P<0.001）。但培养12小时后,每种口腔细菌与PAO1的共同侵入均更大程度地导致了肺上皮细胞的凋亡（P<0.001）。口腔细菌对细胞凋亡的调节因细菌种类的不同而各异。P.gingivalis和S.gordonii在培养1-6小时后诱导的细胞凋亡明显高于其它口腔细菌单独侵入。但是当PAO1与P.gingivalis或S.gordonii与PAO1共同培养12小时后,细胞中caspase-3的活性明显低于共同培养于其它口腔细菌与PAO1时。而且F.nucleatum与PAO1的共同侵入诱导的caspase-3活性最高。3、口腔细菌对PAO1感染肺上皮细胞产生IL-6和IL-8的影响除了P.gingivalis之外,其它所有检测的口腔细菌感染均较PAO1单独感染能诱导更多的细胞因子释放。P.gingivalis培养4小时和12小时似乎分别减少了肺上皮细胞的IL-6和IL-8的产生。共同培养于PAO1和口腔细菌时,细胞因子的分泌与单独培养于这些口腔细菌时相比轻度减少。在培养6小时和12小时后,F.nucleatum是肺上皮细胞分泌IL-6和IL-8最强的刺激因子。一般说来,上皮细胞分泌IL-6先于IL-8,其达峰时问也先于后者。三、牙龈卟啉单胞菌与绿假单胞菌共同感染呼吸道上皮细胞的机制研究使用PCR方法对牙龈卟啉单胞菌与绿脓假单胞菌共同作用于肺上皮细胞凋亡蛋白表达和信号传导途径的分析。1、牙龈卟啉单胞菌与绿脓假单胞菌共同作用的肺上皮细胞的和牙龈卟啉单胞菌单独作用的肺上皮细胞的STAT3信号通路在感染2个小时被激活。共同培养时激活通路的趋势比单独培养时更加明显。2、Bcl-2家族的促凋亡（Bad）和抑凋亡（Bcl-2）蛋白的表达。凋亡促进蛋白Bad在侵入2小时增加;在侵入4小时,Bad促凋亡的趋势被抑制;在侵入8小时,Bad凋亡蛋白出现峰值,提示细胞凋亡加剧;到侵入12个小时,大部分的细胞已凋亡和死亡。与Bad相对应的抑凋亡蛋白Bcl-2的各时段在牙龈卟啉单胞菌与绿脓假单胞菌共同作用于肺上皮细胞的趋势基本对应。3、Survivin具有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的作用,Survivin位于STAT3的下游,感染2小时增高。这是因为细胞在初期受到损伤时会出现应激性的修复,感染4小时对凋亡的抑制表现出来,感染8小时以后随着细胞损伤逐渐的加重,已经不能修复,所以Survivin的作用趋势是逐渐下降。结论1、PAO1与口腔细菌共同作用于肺上皮细胞时,口腔细菌促进PAO1对宿主细胞的黏附能力都未被明显增强。反而,P.gingivalis和A.actinomycetemcomitans还减少了PAO1的黏附细胞的能力。对于P.gingivalis、F.nucleatum、A.actinomycetemcomitans等牙周致病菌能够使侵入肺上皮细胞的绿脓假单胞菌细菌的数量增加1-3倍。相反,A.naeslundii和S.gordonii等牙周非致病性细菌对绿脓假单胞菌细菌入侵上皮细胞没有明显影响。检测细胞的代谢剂对细菌侵入的作用,发现牙周致病菌促进绿脓假单胞菌侵入肺上皮细胞主要是通过调节微管、蛋白合成和能量代谢。进一步支持不良的口腔卫生习惯与呼吸系统感染有相关性。2、牙周致病菌与PAO1一起侵入时能够明显刺激肺上皮细胞产生更多的细胞因子的释放,同时诱导肺上皮细胞的细胞凋亡。提示体内条件下由于口腔细菌侵入呼吸道上皮粘膜表面并随后诱导细胞凋亡和细胞因子释放可能改变局部的微环境,促进宿主体内呼吸系统感染的发生和发展。3、牙龈卟啉单胞菌与绿脓假单胞菌共同作用于肺上皮细胞,当牙龈卟啉单胞菌的浓度达到一定量的时候,进而激活肺上皮细胞的JAK/STAT3传导途径,来调节STAT3的下游的Bcl-2家族和Survivin的蛋白,表现为牙龈卟啉单胞菌可在一段时间内暂时地抑制细胞凋亡,推测其机制是在短时间内对肺上皮细胞黏附,内化,并使细菌更多地在细胞内增殖,最终达到肺部炎症加剧的结局。所以牙周病对于肺部感染有着重大的影响。

论文目录

• 一、 摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、 英文缩略语
• 三、 论文
• 论文一 口腔细菌对绿脓假单胞菌黏附及侵入肺上皮细胞的影响实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文二 牙周致病菌调节绿脓假单胞菌入侵肺上皮细胞所致细胞炎症反应及细胞凋亡的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文三 牙龈卟啉单胞菌对绿脓假单胞菌入侵肺上皮细胞影响凋亡因子表达及其传导通路的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 四、 本研究创新性的自我评价
• 五、 参考文献
• 六、 附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简历