罗非鱼皮胶原肽的制备及其抗氧化活性的研究

论文摘要

本论文研究了罗非鱼皮胶原蛋白的复合酶解工艺、罗非鱼皮胶原酶解液的体外抗氧化性质和罗非鱼皮胶酶解液中具有自由基清除活性的肽的分离纯化。（1）将罗非鱼皮经酸碱前处理后用45℃热水提取12h,得到胶原蛋白,经测定,提取率为13.6%（湿基）,纯度为89.87%,胶原中蛋白含量为95.05%（干基）。采用菠萝蛋白酶、A1calase酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶将罗非鱼皮胶原蛋白进行酶解,根据各酶解液对O2-·的清除效果,确定了菠萝蛋白酶和A1calase酶这两种活性较高的酶为水解用酶。经过正交试验,确定了这两种酶单独水解罗非鱼皮胶原蛋白制备O2-·清除活性肽的最佳酶解工艺:菠萝蛋白酶为45℃,pH4.5,酶用量2000U/g,4h,底物浓度6%;Alcalase酶为55℃,pH7.5,酶用量3600U/mL,2h,底物浓度4%。在单酶最适酶解工艺的基础上,将这两种酶复合水解,得到最佳复合酶解工艺:先用菠萝蛋白酶水解,再用Alcalase酶水解。采用该工艺所得酶解液对O2-·的清除效果最好,其抑制率为72.3%。（2）测定了用最佳复合酶解工艺水解罗非鱼皮胶原所得酶解液的体外抗氧化活性。该酶解液对O2-·和·0H具有较好的清除作用,对H2O2具有一定的清除效果,还具有一定的还原能力,对Fe2+诱发的卵黄脂蛋白的过氧化有较好的抑制作用,对花生油和猪油的氧化也有一定的抑制作用。总体而言,罗非鱼皮胶原酶解液在不同抗氧化体系中均表现出一定的体外抗氧化效果,具有很好的开发利用前景。（3）以O2-·清除活性为指标,对罗非鱼皮胶原酶解液进行了分离纯化。罗非鱼皮胶原酶解液经截流分子量为10kDa、5kDa、3kDa、lkDa的超滤膜分离后,’得到了分子量范田不同的五种组分（>10 kDa、10-5 kDa、5-3 kDa、3-l kDa和<1 kDa）,其中,分子量<lkDa的组分O2-·清除活性最高,IC50。值为2.18×103μg/mL。<lkDa的组分经Sephadex G-25凝胶柱层析后得到4个峰,其中第4个峰D峰的O2-·清除活性最高,IC50值为17.3μg/mL。D峰经SP Sephadex C-25离子交换柱层析后得到5个峰,其中第二个峰D2峰的O2-·清除活性最高,IC50值为8.62μg/mL。将D2峰脱盐后采用反压高效液相色谱C18制备柱进一步纯化,得到单一峰,经

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 0 绪论
• 0.1 鱼皮胶原蛋白
• 0.2 自由基的研究进展
• 0.3 抗氧化肽的研究进展
• 0.4 抗氧化肽的作用机理
• 0.5 立题背景和意义
• 1 罗非鱼皮胶原白酶解液的制备
• 引言
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验原料
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.1.4 实验方法
• 1.1.4.1 鱼皮胶原蛋白的提取
• 1.1.4.2 羟脯氨酸含量的测定
• 1.1.4.3 胶原中总氮的测定
• 1.1.4.4 酶活力的测定
• 1.1.4.5 罗非鱼皮胶原蛋白的最佳水解酶的确定
• 1.1.4.6 正交试验
• 1.1.4.7 复合酶解工艺的确定
• 2^-·）的清除作用'>1.1.4.8 酶解液对超氧阴离子（O₂^-·）的清除作用
• 1.1.4.9 可溶性蛋白的测定
• 1.1.4.10 氨基氮的测定：茚三酮比色法
• 1.1.4.11 酶解液水解度（DH）的测定
• 1.1.4.12 数据处理
• 1.2 结果与讨论
• 1.2.1 罗非鱼皮胶原蛋白的提取率及纯度
• 1.2.2 酶活力的测定
• 1.2.3 七种蛋白酶的酶解效果比较
• 1.2.4 A1calase 酶解罗非鱼皮胶原蛋白条件的优化
• 1.2.5 菠萝蛋白酶解罗非鱼皮胶原蛋白条件的优化
• 1.2.6 复合酶解工艺的确定
• 1.3 小结
• 2 罗非鱼皮胶原酶解液的体外抗氧化效果
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 酶解液蛋白浓度的测定
• 2.1.3.2 对羟自由基（·OH）的清除作用
• 2^-·）的清除作用'>2.1.3.3 对超氧阴离子（O₂^-·）的清除作用
• 2O₂的清除作用'>2.1.3.4 对 H₂O₂的清除作用
• 2.1.3.5 还原能力的测定
• 2.1.3.6 抗脂质过氧化作用
• 2.1.3.7 POV 值的测定
• 2.1.3.8 数据分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 罗非鱼皮胶原酶解液对OH·的清除作用
• 2^-·的清除作用'>2.2.2 罗非鱼皮胶原酶解液对O₂^-·的清除作用
• 2O₂的清除作用'>2.2.3 罗非鱼皮胶原酶解液对H₂O₂的清除作用
• 2.2.4 罗非鱼皮胶原酶解液的还原能力
• 2.2.5 罗非鱼皮胶原酶解液的抗脂质过氧化作用
• 2.2.6 罗非鱼皮胶原酶解液对大豆油和猪油的抗氧化作用
• 2.3 小结
• 3 抗氧化肽的分离、纯化及鉴定
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验方法
• 3.1.3.1 抗氧化活性的测定方法
• 3.1.3.2 超滤分离
• 3.1.3.3 凝胶柱层析
• 3.1.3.4 离子交换柱层析
• 3.1.3.5 脱盐
• 3.1.3.6 反压高效液相色谱分离
• 3.1.3.7 罗非鱼皮胶原酶解液的纯化效果
• 3.1.3.8 肽的氨基酸组成分析
• 3.1.3.9 肽的分子量分析
• 3.1.3.10 数据分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 超滤分离及其产物抗氧化活性分析
• 3.2.2 凝胶柱层析及其产物抗氧化活性分析
• 3.2.3 离子交换柱层析及其产物抗氧化活性分析
• 3.2.4 反压高效液相色谱分离及其产物抗氧化活性分析
• 3.2.5 罗非鱼皮胶原酶解液的纯化效果
• 3.2.6 T峰的氨基酸组成
• 3.2.7 T峰的质谱分析
• 3.3 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢