固定化微环境对红豆杉细胞初生代谢和次生代谢的影响

论文摘要

用聚氨酯泡沫为载体固定化红豆杉细胞以构建微环境,通过测定分析细胞壁表面化学成分、膜脂肪酸组分、活性氧、金属离子和紫杉醇等生化指标,研究了微环境对红豆杉细胞初生代谢和次生代谢的影响。运用X光光电子能谱仪对东北红豆杉细胞壁表面化学成分进行了分析。结果表明固定化载体表面的细胞壁的N/C、N/P和多肽类化合物显著高于固定化细胞,而碳氢化合物和多糖物质则明显低于固定化细胞。固定化细胞壁表面的K/C、N/C和N/P呈下降趋势。采用双水相分离法、气相色谱技术以及外源H2O2添加等手段,分别考察了膜脂肪酸组分及活性氧的含量变化和紫杉醇合成的关系。结果发现固定化细胞的膜亚油酸和亚麻酸含量增多,而硬脂酸含量下降,膜脂肪酸组分趋向不饱和化和脂肪酸不饱和指数（IUFA）增高,固定化细胞的紫杉醇含量与IUFA变化有较好的同步性,而与硬脂酸含量呈负相关性。固定化细胞胞内H2O2及微环境溶液内H2O2和O2-。的含量在细胞生长晚期（20天后）显著地增加,添加H2O（215μM和20μM）能促进细胞的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和紫杉醇生物合成,但对膜脂过氧化产物（MDA）和膜通透性没有影响。运用电感耦合等离子发射光谱仪对位于固定化载体不同层面的细胞K+、Ca2+和Mg2+进行了测定,分析了固定化不同层细胞的K+、Ca2+和Mg2+含量分布和紫杉醇合成之间的关系。结果得出固定化内层细胞的离子含量变化规律为:Ca2+>Mg2+>K+,中层和外层细胞的离子含量变化规律为:K+>Ca2+>Mg2+。固定化内层细胞的Ca2+和Mg2+含量显著地高于中层和外层细胞,而K+含量则明显低于中层和外层细胞,而且内层细胞的紫杉醇含量也显著高于中层和外层细胞。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 固定化微环境的定义
• 1.2 固定化微环境的种类
• 1.2.1 包埋法固定化微环境
• 1.2.2 吸附固定化微环境
• 1.2.3 其他固定化微环境
• 1.3 固定化微环境的理化性质和对细胞的影响机制
• 1.3.1 固定化微环境的物理和化学性质
• 1.3.2 固定化微环境对细胞的影响机制
• 1.3.3 固定化细胞的数学模型
• 1.4 促进固定化细胞目的产物释放的措施
• 1.4.1 培养条件变化
• 1.4.2 运用物理和化学手段增加膜通透性
• 1.4.3 两相培养法
• 1.5 固定化微环境细胞培养工程策略
• 1.5.1 明确某种植物细胞是否需要固定化微环境培养
• 1.5.2 获得外泌型（至少是部分的）高产细胞系
• 1.5.3 选择合适的固定化微环境
• 1.5.4 前体饲喂
• 1.5.5 运用多种手段促进细胞目的产物分泌
• 1.5.6 选择合理的生物反应过程和合适的生物反应器
• 1.6 本文研究目的及主要内容
• 第二章 固定化过程中红豆杉细胞壁表面化学成分含量的变化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 细胞株系及培养
• 2.2.3 聚氨酯泡沫预处理及固定化微环境培养条件的建立
• 2.2.4 细胞生物量的测定
• 2.2.5 固定化细胞的释放
• 2.2.6 细胞的X 光光电子能谱仪（XPS）分析
• 2.2.7 环境扫描电子显微镜观察
• 2.2.8 实验设计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 固定化过程细胞生物量的变化
• 2.3.2 细胞壁表面化学成分的 XPS 分析
• 2.4 小结
• 第三章 微环境对红豆杉细胞膜 ATPase 活性及脂肪酸组分含量的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 细胞株系及培养
• 3.2.3 细胞生物量的测定
• 3.2.4 培养液的提取
• 3.2.5 pH 的测定
• 3.2.6 电导率的测定
• 3.2.7 固定化细胞的释放
• 3.2.8 细胞膜的提取
• +-ATPase 和Ca²⁺-ATPase 活性的测定'>3.2.9 H⁺-ATPase 和Ca²⁺-ATPase 活性的测定
• 3.2.10 膜脂肪酸提取
• 3.2.11 膜脂肪酸组分测定及不饱和指数（IUFA）的计算
• 3.2.12 可溶性蛋白质含量的测定
• 3.2.13 PAL 活性的测定
• 3.2.14 紫杉醇含量的测定
• 3.2.15 实验设计
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 微环境对细胞生长的影响
• 3.3.2 微环境内pH 的变化
• 3.3.3 微环境对电导率的影响
• 3.3.4 膜纯度的测定
• +-ATPase 和 Ca²⁺-ATPase 活性的影响'>3.3.5 微环境对膜 H⁺-ATPase 和 Ca²⁺-ATPase 活性的影响
• 3.3.6 微环境对膜脂肪酸组分的影响
• 3.3.7 微环境对可溶性蛋白质含量的影响
• 3.3.8 微环境对 PAL 活性的影响
• 3.3.9 微环境对紫杉醇合成的影响
• 3.3.10 膜脂肪酸组分含量与紫杉醇合成的动态变化关系
• 3.4 小结
• 第四章 微环境对红豆杉细胞活性氧含量和紫杉醇合成的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 细胞株系及培养
• 4.2.3 固定化细胞的释放
• 4.2.4 丙二醛（MDA）含量的测定
• 4.2.5 细胞膜通透性的测定
• 4.2.6 培养液的提取
• 2O₂含量的测定'>4.2.7 H₂O₂含量的测定
• 2^·-含量的测定'>4.2.8 O₂^·-含量的测定
• 4.2.9 PAL 活性测定
• 4.2.10 紫杉醇含量的测定
• 4.2.11 实验设计
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 微环境对细胞膜脂过氧化的影响
• 4.3.2 微环境对细胞膜通透性的影响
• 2O₂含量的变化'>4.3.3 微环境对胞内 H₂O₂含量的变化
• 2^·-含量的变化'>4.3.4 微环境对胞外 O₂^·-含量的变化
• 2O₂含量的变化'>4.3.5 微环境对胞外 H₂O₂含量的变化
• 4.3.6 释放细胞胞内 H202含量的变化
• 2O₂对细胞膜通透性和细胞生长的影响'>4.3.7 添加 H₂O₂对细胞膜通透性和细胞生长的影响
• 2O₂对细胞膜通透性和次生代谢的影响'>4.3.8 添加 H₂O₂对细胞膜通透性和次生代谢的影响
• 4.3.9 活性氧含量变化与紫杉醇合成的关系
• 4.4 小结
• 第五章 微环境对红豆杉细胞金属离子含量分布和紫杉醇合成的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 细胞株系及培养
• 5.2.3 固定化载体的分层定义
• 5.2.4 固定化细胞的释放
• +、Mg²⁺和 Ca²⁺的提取'>5.2.5 细胞内 K⁺、Mg²⁺和 Ca²⁺的提取
• 5.2.6 培养液的提取
• +、Mg²⁺和 Ca²⁺的测定'>5.2.7 K⁺、Mg²⁺和 Ca²⁺的测定
• 5.2.8 紫杉醇含量的测定
• 5.2.9 实验设计
• 5.3 结果与讨论
• +含量的测定'>5.3.1 胞外和胞内 K⁺含量的测定
• 2+含量的变化'>5.3.2 胞外和胞内 Mg²⁺含量的变化
• 2+含量的测定'>5.3.3 胞外和胞内 Ca²⁺含量的测定
• 5.3.4 固定化不同层面细胞胞内紫杉醇含量的变化
• 5.3.5 固定化不同层面细胞生物量的测定
• +、Mg²⁺和Ca²⁺的含量和紫杉醇含量的变化关系'>5.3.6 胞内 K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的含量和紫杉醇含量的变化关系
• 5.4 小结
• 第六章 微环境内营养物质消耗和紫杉醇合成的动态关系
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试剂
• 6.2.2 细胞株系及培养
• 6.2.3 细胞生物量的测定
• 6.2.4 固定化细胞的释放
• 6.2.5 培养液的提取
• 6.2.6 pH 的测定
• 6.2.7 电导率的测定
• 6.2.8 果糖含量的测定
• 6.2.9 蔗糖含量的测定
• 6.2.10 葡萄糖含量的测定
• 6.2.11 硝态氮含量的测定
• 6.2.12 可溶性磷含量的测定
• 6.2.13 紫杉醇的提取和含量测定
• 6.2.14 实验设计
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 微环境对南方红豆杉细胞生长的影响
• 6.3.2 微环境内pH 的变化
• 6.3.3 微环境内电导率的变化
• 3^-浓度的影响'>6.3.4 微环境对胞外 NO₃^-浓度的影响
• 6.3.5 微环境内可溶性磷含量的变化
• 6.3.6 微环境对胞外蔗糖含量的影响
• 6.3.7 微环境对胞外果糖含量的影响
• 6.3.8 微环境对胞外葡萄糖含量的影响
• 6.3.9 微环境对紫杉醇含量的影响
• 6.3.10 微环境内营养物质消耗和紫杉醇合成的关系
• 6.4 小结
• 第七章 微环境对红豆杉细胞抗氧化酶活性的时空影响
• 7.1 引言
• 7.2 实验与方法
• 7.2.1 试剂
• 7.2.2 细胞株系及培养
• 7.2.3 固定化载体的分层定义
• 7.2.4 固定化细胞的释放
• 7.2.5 胞内酶的提取
• 7.2.6 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 7.2.7 过氧化氢酶（CAT）活性的测定
• 7.2.8 过氧化物酶（POD）活性的测定
• 7.2.9 抗坏血酸-过氧化物酶（APX）活性的测定
• 7.2.10 脂氧合酶（LOX）活性的测定
• 7.2.11 MDA 含量的测定
• 7.2.12 多酚氧化酶（PPO）活性的测定
• 7.2.13 PAL 活性的测定
• 7.2.14 实验设计
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 微环境对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
• 7.3.2 微环境对过氧化氢酶（CAT）活性的效应
• 7.3.3 微环境对过氧化物酶（POD）活性的影响
• 7.3.4 微环境对抗坏血酸-过氧化物酶（APX）活性的影响
• 7.3.5 微环境对脂氧合酶（LOX）活性的影响
• 7.3.6 微环境对细胞MDA 含量的影响
• 7.3.7 微环境对多酚氧化酶（PPO）活性的效应
• 7.3.8 微环境对细胞PAL活性的效应
• 7.4 小结
• 第八章 结论与展望
• 8.1 结论
• 8.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况
• 缩写词与符号表
• 致谢