小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因介导的对西瓜病毒抗性的研究

论文摘要

通过病毒或植物来源的基因转化植物获得抗病毒的工程植株,已经成为生物工程中获得抗病毒资源的主要措施之一。病毒的外壳蛋白基因作为目的基因的转基因策略是研究最早、最成熟的技术,其介导抗性的机理（RNA水平或蛋白质水平）虽目前还存在争议,但由于RNA水平介导的抗性更安全、高效,已成为植物抗病毒基因工程研究的热点。本研究主要开展以下的工作: 1.构建非翻译的小西葫芦黄花叶病毒（Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV）外壳蛋白基因植物表达载体。本研究以该病毒中国分离物外壳蛋白基因（不含起始密码子）的克隆载体ZCP-87为材料,利用分子生物学技术与pBin438载体连接构建非翻译的植物表达载体（重组质粒命名为:pBZCP5）。重组质粒经PCR和Sal Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证,均表明已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上,本工作为利用植物基因工程培育抗病毒西瓜奠定了基础。 2.建立ZKM西瓜材料高效再生体系。该材料成熟胚的最佳消毒方案是70%酒精预处理30s,然后0.1%升汞消毒5min,无菌水冲洗3-5次,最适萌发培养基为0.8%琼脂糖,先暗培养3d,再转至培养室光照培养3d,种子萌发很快,无菌苗生长健壮。用生长一周后的无菌苗子叶作为外植体,适宜的诱导分化培养基是MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L IAA,分化频率达97.7%,芽苗在MS固体培养基且附加KT浓度0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L时均可得到良好的伸长效果,都能促进芽苗生长健壮。西瓜转化体的卡那霉素（Kan）筛选浓度为100mg/L。 3.应用叶盘法将外源基因导入ZKM西瓜材料,再生苗在含有卡那霉素（Kan）的培养基上筛选培养,获得了抗卡那霉素抗性的芽,并对少许芽进行了PCR鉴定,已扩增出与目的基因大小一致的条带,这表明目的基因已经整合到植物基因组中。

论文目录

• 目录
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 抗病毒基因工程研究现状
• 1.1.1 病毒病发生危害及防治测略
• 1.1.2 抗病毒基因工程策略及其特点
• 1.1.3 转基因工程植株抗病性提高的新策
• 1.1.4 新的抗病毒策略探讨
• 1.2 小西葫芦黄化花叶病毒病的研究概况
• 1.2.1 小西葫芦黄化花叶病毒病的发生与危害情况
• 1.2.2 小西葫芦黄化花叶病毒的多样性
• 2 引言
• 3 ZYMV外壳蛋白基因植物表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 目的基因的获得
• 3.2.2 pBin438载体质粒双酶切及回收
• 3.2.3 目的基因与载体的连接及重组子验证
• 3.2.4 重组子pBZCP5对农杆菌的转化验证
• 3.3 讨论
• 4 西瓜再生系统的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同消毒时间和培养基种类对种子萌发的影响
• 4.2.2 不同培养基对愈伤组织形成及芽诱导的影响
• 4.2.3 不同培养基对不定芽的伸长及生根的影响
• 4.2.4 不同卡那霉素浓度对芽生长的影响
• 4.3 讨论
• 5 ZYMV外壳蛋白基因植物表达载体对西瓜的遗传转化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 西瓜叶盘的转化及抗性芽的形成
• 5.2.2 抗性芽的分子检测
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• ABSTRACT