论文摘要
研究背景:白血病是青壮年及儿童最常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年上升。近20余年来,随着联合化疗、造血干细胞移植等技术的不断推广应用,白血病的5年生存率大大提高,但是由于白血病细胞的免疫逃逸,使许多患者仍然难逃复发的厄运。造成免疫逃逸的重要原因是白血病细胞的免疫原性低或缺乏特异性抗原。因此,近年来各种以基因治疗为主的生物学治疗成为白血病治疗的一种新的、可行的手段。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成员之一,它在细胞存活、维持细胞有丝分裂的正常进行所起的关键作用以及选择性在肿瘤组织中表达的特性,使之成为白血病免疫治疗的一个新的靶点。现阶段国际上肿瘤疫苗的研究热点集中于重组基因疫苗和融合细胞疫苗,如何提高疫苗的效价是肿瘤疫苗最终能否应用于临床的关键。Survivin在细胞存活、维持细胞有丝分裂方面起到关键作用而且在肿瘤组织中选择表达,B7-1是抗原呈递细胞表面与T细胞协同刺激分子CD28和CTLA-4相互作用的配体,可促进多种抗原诱导的免疫反应。将稳定表达survivin/B7-1的K562细胞系,与DC细胞融合以观察其对肿瘤的免疫防治效果,因而以细胞融合法制备肿瘤疫苗可有效的增强对survivin及其他肿瘤抗原的提呈,增强机体的抗肿瘤免疫反应,它在肿瘤的防治方面会有良好的应用前景。目前国内外关于survivin/B7-1转基因修饰的白血病疫苗的研究尚属空白。本试验在进一步明确survivin在白血病细胞表达情况的基础上,构建含有人survivin基因的表达质粒并转染K562细胞,为后续建立稳定表达survivin/B7-1的K562细胞系及白血病的靶向治疗研究做准备。实验方法:第一部分:收集64例符合FAB--MICM诊断标准的急性白血病患者骨髓液标本,Trizol提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测标本中survivin mRNA表达,并进行半定量分析。第二部分:在GeneBank中确定所需基因的序列号为BC065497,将含有该基因的载体质粒经PCR方法扩增后,基因测序鉴定所获基因序列的正确性。将扩增产物连接至T载体,转化DH5a感受态细胞,挑取单克隆菌株过夜培养。小量提取质粒进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳后回收产物连接至带有绿色荧光的pIRES2-EGFP载体（Bam HI/EcoR I双酶切）,将最终产物命名为pIRES2-EGFP-Survivin。常规培养K562细胞,取其对数生长期,用SuperFect转染液将pIRES2-EGFP-Survivin转染入K562细胞,观察24h、48h及72h时段荧光表达。并采用RT-PCR方法检测转染后相应时间点K562细胞中survivin mRNA表达量。结果:1.急性白血病患者survivin mRNA表达阳性率与正常对照组间有统计学差异（P<0.05）。急性白血病患者survivin mRNA表达水平与正常对照组间有统计学差异（P< 0.05）。2.急性白血病初治组、复发组及缓解组阳性表达率和表达量与正常对照组之间比较均有统计学差异（P<0.05）,初治组和复发组与缓解组间均有统计学差异（P<0.05）,但初治组和复发组两组间阳性表达率和表达量无统计学差异（P>0.05）。各FAB--MICM分型由于例数限制,未进行亚型间统计。3.获得正确的人全长survivin序列。4.成功构建人全长survivin真核表达质粒pIRES2-EGFP-Survivin。5.成功将pIRES2-EGFP-Survivin转入K562细胞。6.检测到转染后的K562细胞中survivin mRNA表达量较转染前增加。结论:1.急性白血病患者survivin mRNA的表达阳性率高于正常对照组,这与文献报道一致,且其表达量在初发、复发及缓解时都较正常对照高,这些都提示survivin表达紊乱可能在急性白血病的发病过程中起重要作用,且有可能成为治疗及预后的指标之一。2.目前国内外关于Survivin/B7-1转基因修饰的白血病疫苗的研究尚属空白,导入survivin和B7-1的双表达质粒DNA的K562细胞可获得充足的各种共刺激分子,增强机体的抗肿瘤免疫反应,在肿瘤的防治方面会有良好的应用前景。本试验成功构建人全长survivin真核表达载体pIRES2-EGFP-Survivin,并在K562细胞中顺利表达,转染后survivin mRNA表达量增加,为后续建立稳定表达Survivin/B7-1的K562细胞系及白血病的靶向治疗研究奠定了基础。
论文目录
相关论文文献
- [1].上皮性卵巢癌患者Survivin蛋白表达与病理特征的相关性[J]. 当代医学 2019(35)
- [2].甲状腺乳头状癌中Survivin、VEGF、EGFR的表达及临床意义分析[J]. 癌症进展 2016(10)
- [3].凋亡抑制因子Survivin在多发性骨髓瘤中表达的研究进展[J]. 内蒙古医学杂志 2016(12)
- [4].Survivin和VEGF在口腔鳞状细胞癌中的表达[J]. 中国社区医师 2017(03)
- [5].靶向沉默HIF-1α和Survivin基因对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗敏感性的影响[J]. 贵州医科大学学报 2017(04)
- [6].Survivin蛋白在甲状腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 广西医科大学学报 2017(05)
- [7].Survivin、CD44表达水平与乳腺癌患者预后生存期的关系[J]. 世界最新医学信息文摘 2017(30)
- [8].Survivin基因在肝细胞肝癌中的表达及意义[J]. 世界最新医学信息文摘 2017(52)
- [9].胃癌发生过程中Survivin促血管生成作用的研究[J]. 现代消化及介入诊疗 2016(02)
- [10].Survivin、VEGF、EGFR在甲状腺乳头状癌中的表达及意义[J]. 安徽医科大学学报 2016(03)
- [11].Survivin和PTEN在肾透明细胞癌中的表达及临床意义[J]. 中国社区医师 2016(16)
- [12].子宫内膜癌中Survivin与EGFR的表达及其临床意义[J]. 温州医科大学学报 2016(08)
- [13].Survivin和COX-2蛋白的异常表达与壶腹癌的临床病理特征及预后的关系[J]. 中国现代普通外科进展 2016(05)
- [14].索拉非尼对宫颈癌细胞的增殖抑制作用及对PCNA、Survivin表达的影响[J]. 临床肿瘤学杂志 2016(07)
- [15].Survivin拮抗肽对小鼠移植性神经胶质瘤的抑制研究[J]. 内蒙古医学杂志 2016(06)
- [16].Survivin在腺性膀胱炎与膀胱腺癌中的表达及临床意义[J]. 华夏医学 2014(05)
- [17].Survivin与黑素瘤关系的研究进展[J]. 中国麻风皮肤病杂志 2009(09)
- [18].Survivin、MMP-9在慢性宫颈炎中的表达及宫颈环形电切术联合聚甲酚磺的干预作用研究[J]. 实用预防医学 2015(05)
- [19].survivin在肝癌中的临床应用研究进展[J]. 医学综述 2015(14)
- [20].尿Survivin蛋白检测辅助诊断膀胱移行细胞癌的临床意义分析[J]. 现代诊断与治疗 2015(15)
- [21].HIF-1α、Survivin在非小细胞肺癌中的表达[J]. 安徽医科大学学报 2015(11)
- [22].成釉细胞瘤中Survivin的表达研究进展[J]. 内蒙古医科大学学报 2015(S1)
- [23].Survivin在膀胱移行细胞癌及腺性膀胱炎中的表达及临床意义[J]. 中国现代医学杂志 2013(35)
- [24].胃癌中Survivin、PTEN蛋白的表达及临床相关性分析[J]. 实用癌症杂志 2020(08)
- [25].survivin对血小板源生长因子刺激的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响及机制[J]. 中国老年学杂志 2019(08)
- [26].Ki-67、survivin在伴鸡皮样改变大肠腺瘤中表达的临床意义[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2017(01)
- [27].洛伐他汀克服吉非替尼耐药与整合素β1、Survivin的相关性分析[J]. 第二军医大学学报 2017(02)
- [28].氟对大鼠牙胚发育中survivin蛋白表达的影响[J]. 上海口腔医学 2017(03)
- [29].凋亡抑制基因survivin与稽留流产发病机制的相关性研究[J]. 中国实用医药 2017(18)
- [30].Survivin和PTEN在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究[J]. 广州医学院学报 2013(06)