戊型肝炎病毒ORF2和ORF3多肽的抗原性及ORF3多肽的免疫原性研究

论文摘要

戊型肝炎是全世界范围内的一个公共卫生问题,在发展中国家尤甚。本论文从3例戊型肝炎患者和1例感染戊型肝炎病毒的猪的粪便悬液中克隆4株HEV的基因组,并将其基因构建成cDNA克隆。序列分析显示该4株HEV中有1株为基因1型,3株为基因4型。在此基础上,本论文构建了18个分别表达1型和4型HEV ORF2和ORF3蛋白片段的克隆,进行原核表达和纯化。将纯化后的各多肽分别制备成HEV IgM和IgG抗体EIA检测试剂。使用制备的抗体检测试剂分别检测实验感染了不同基因型HEV的猴系列血清及临床HE患者的系列血清,比较不同基因型HEV对应位置多肽的抗原性差异、同一基因型HEV不同位置多肽之间的抗原性差异。结果显示,对于HEV IgM试剂,ORF2 N端和C端抗原组合使用可以取得最佳的检测效果;对于HEV IgG试剂,主要抗原位点集中在ORF2蛋白的两末端:N端多肽主要参与HE急性期抗体反应,且持续时间较短,C端多肽对应抗体出现也较早,但是持续时间相对较长,该多肽和恢复期血清有很强的结合能力;ORF2蛋白的抗原性在不同基因型之间无明显差异;ORF3蛋白的抗原位点主要集中在C端,且其抗原性在不同基因型之间存在差异。以上结论为优化HEV抗体检测试剂提供了数据支持。本论文还将原核表达的4型HEV ORF3抗原免疫恒河猴,并分别用1型和4型HEV毒株攻击免疫的恒河猴,以考察原核表达的HEV ORF3蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的ORF3蛋白可以部分保护试验动物免于HEV感染。这部分工作为HEV ORF3的功能研究及HE疫苗的开发提供了数据参考。

论文目录

• 内容提要
• 缩略词
• 第一章 前言
• 1.1 戊型肝炎病毒（HEV）的研究现状
• 1.1.1 戊型肝炎病毒
• 1.1.2 HEV的细胞培养
• 1.1.3 HEV感染性克隆研究现状
• 1.1.4 HEV动物模型的建立
• 1.2 戊型肝炎（HE）的研究现状
• 1.2.1 HE临床诊断
• 1.2.2 HE的流行病学研究
• 1.3 HEV抗原表位及诊断试剂的研究进展
• 1.3.1 HEV抗原表位研究进展
• 1.3.2 HE诊断技术的发展现状
• 1.4 HE疫苗的研究进展
• 1.4.1 HE疫苗的研究概况
• 1.4.2 HE疫苗的临床前评价
• 1.4.3 HE疫苗临床实验最新进展
• 1.5 本论文的设计思想
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 材料标本
• 2.1.3 试剂及耗材
• 2.1.4 常用试剂的合成及配制
• 2.2 方法及试剂
• 2.2.1 基本实验操作
• 2.2.2 基因克隆及序列分析
• 2.2.3 重组蛋白的基因克隆
• 2.2.4 重组蛋白的表达与纯化
• 2.2.5 EIA方法的建立
• 2.2.6 恒河猴感染试验
• 第三章 结果和讨论
• 3.1 HEV cDNA克隆的构建
• 3.1.1 序列拼接
• 3.1.2 HEV分离株基因序列的分析
• 3.1.3 cDNA克隆的构建
• 3.1.4 讨论
• 3.2 ORF2和ORF3多肽的抗原性分析
• 3.2.1 分段克隆及表达载体的构建
• 3.2.2 蛋白的表达及纯化鉴定
• 3.2.3 各重组蛋白检测HEV IgM抗体的能力
• 3.2.4 各重组蛋白检测HEV IgG抗体的能力
• 3.2.5 讨论
• 3.3 ORF3蛋白的免疫原性分析
• 3.3.1 ORF3蛋白的免疫原性分析
• 3.3.2 讨论
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表论文
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract