双胚苗水稻中单倍体与二倍体表型和基因表达的差异分析

论文摘要

SARII-628是四川农业大学水稻所的一个双胚苗自然群体，每年都能定期分离出单倍体与二倍体（n：2n）、二倍体与三倍体（2n：3n）的双苗植株。其单倍体的异交结实率明显高于普通的单倍体，其三倍体的杂交后代会出现早世代稳定的现象。本研究对单倍体及其对应二倍体的外观形态、农艺性状及细胞学行为进行研究，发现单倍体在终变期的染色体主要构型是12个Ⅰ，在后期Ⅰ染色体的分离方式也多种多样，其中以6-6的方式居多。在DNA水平上进行分子生物学研究，发现它们在基因组上没有差别，从而表明这些表型差异是由水稻的倍性造成的。本实验在DNA水平上和RNA水平上选用了甲基化分析、基因芯片技术、cDNA-AFLP和RT-PCR技术等来研究这些与倍性相关的基因表达的差异变化，具体结果如下： 一、本研究用改良AFLP方法（MSAP）分析了5个单倍体及其对应二倍体总DNA 5’-CCGG位点胞嘧啶的甲基化水平和单倍体与对应二倍体的甲基化差异模式。研究发现单倍体的甲基化水平高于对应的二倍体，是单倍体相对于二倍体甲基化模式经过重新调整，在其基因组中甲基化水平发生了总体变化以适应生存的必然结果。具体结果如下： 1．发现5个二倍体在482个位点上甲基化状态没有差异，与二倍体比较，单倍体虽然在甲基化总体水平上变化不大，但共有43个位点甲基化类型在不同单株上发生了变异。 2．单倍体的甲基化敏感扩增多态性比率即扩增的总甲基化位点数占总扩增位点数的比率平均为18.77％，全甲基化（双链CmCGG）率平均为10.48％，都高于二倍体。表明二倍体突变成单倍体后，某些位点发生了超甲基化。 3．单倍体与其对应二倍体比较，有5种类型的改变：①单倍体与二倍体甲基化模式相同：②去甲基化；③超甲基化；④次甲基化；⑤不定类型。 4．对18个位点测序检索显示：这些甲基化变异涉及整个水稻基因组的12条染色体且具有位点特异性，不同单株的变异位点各不相同。 二、基因芯片技术是新的分子生物学研究工具。本研究运用cDNA基因芯片技

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 一、单倍体技术在水稻上的研究及展望
• 1 单倍体的获得途径
• 1.1 自然发生的单倍体
• 1.2 从双胚苗中选择单倍体
• 1.3 种间或属间远缘杂交
• 1.4 组织和细胞离体培养
• 1.5 核质互作
• 1.6 利用单倍体启动基因
• 2 单倍体产生的可能机制及其遗传规律
• 2.1 阻碍受精因素
• 2.2 胚乳的作用
• 2.3 单倍体的遗传基础
• 3 单倍体结实与它的减数分裂
• 4 单倍体与二倍体的比较研究
• 5 单倍体的遗传优势
• 6 单倍体技术在水稻遗传育种中的应用
• 6.1 单倍体技术在水稻育种中的应用
• 6.2 单倍体技术在水稻物种进化研究上的应用
• 6.3 单倍体技术在水稻遗传学研究上的应用
• 6.4 单倍体技术在水稻分子生物学上的应用
• 二、DNA甲基化及其生物学功能
• 1 DNA甲基转移酶
• 2 DNA甲基化的机制
• 3 MBD蛋白与DNA甲基化的识别
• 4 DNA甲基化检测方法
• 5 DNA甲基化的生物学功能
• 5.1 DNA甲基化是植物正常生长发育所必需
• 5.2 DNA甲基化与转基因植物的基因沉默有关
• 5.3 DNA甲基化在基因组防御中起作用
• 5.4 DNA甲基化还可以使植物花粉处于休眠期
• 5.5 DNA甲基化对于植物的生长发育和组织分化具有十分重要的调控作用
• 5.6 低温可能通过降低DNA甲基化水平而诱导植物开花
• 6 展望
• 三、基因芯片的研究进展
• 1 基因芯片的概念和发展概况
• 2 基因芯片的制备和基本操作
• 2.1 基因芯片的制备
• 2.2 基因芯片的基本操作
• 3 基因芯片在农业研究中的应用
• 3.1 植物发育生物学及植物抗逆性基因表达调控研究
• 3.2 作物品种资源研究与品种改良
• 3.3 转基因植物表达调控研究及转基因作物和农产品的检测
• 3.4 农业微生物研究
• 3.5 畜牧业品种改良及畜禽流行病研究
• 3.6 基因芯片在植物育种上的应用
• 四、其它分子技术的研究进展
• 1 AFLP技术
• 2 RT-PCR技术
• 3 微卫星等标记
• 五、立题依据
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料、药品和仪器
• 1.1 水稻材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 材料的田间处理
• 2.2 DNA和RNA的提取、纯化和定量
• 2.3 SSR分析
• 2.4 MSAP分析
• 2.5 cDNA-AFLP实验程序
• 2.6 数据处理
• 2.7 芯片数据处理流程
• 2.8 RT-PCR分析
• 第三部分 结果与分析
• 1 倍性鉴定
• 2 外观及农艺性状调查
• 2.1 外观
• 2.2 其它农艺性状统计分析
• 3 减数分裂异常行为及花粉育性
• 3.1 花粉母细胞减数分裂观察
• 3.2 花粉育性鉴定
• 4 微卫星分析
• 5 甲基化水平差异分析
• 5.1 MSAP分析
• 5.2 单倍体与相应的二倍体甲基化水平
• 5.3 单倍体与相应的二倍体的不同甲基化类型
• 5.4 甲基化变异遍布于整个基因组且具有位点特异性
• 6 单倍体水稻基因芯片扫描数据的结果分析
• 6.1 芯片杂交与质量控制
• 6.2 SARII-628来源的单倍体与二倍体芯片扫描结果
• 6.3 芯片数据列表
• 6.4 SARII-628来源的单倍体与二倍体的基因表达变化及其比例
• 6.5 单倍化敏感序列的表达量的变化差异比较
• 6.6 单倍化敏感序列在染色体上的分布
• 6.7 单倍化敏感序列的功能分类
• 6.8 单倍化敏感序列与9311基因的功能分类比较
• 7 RT-PCR
• 7.1 ss-cDNA的准备
• 7.2 目标序列的选定
• 7.3 单倍体和对应二倍体的RT-PCR结果
• 7.4 单倍体激活序列的RT-PCR结果
• 7.5 单倍体沉默序列的RT-PCR结果
• 7.6 总体变化位点在单倍体各个器官中的比较
• 8 cDNA-AFLP技术分析
• 8.1 材料的准备及操作
• 8.2 单倍体与对应二倍体的cDNA-AFLP水平变化
• 8.3 单倍体与对应的二倍体的不同表达变化类型
• 8.4 单倍体与二倍体在不同器官上的差异
• 8.5 单倍体之间单株的表达差异
• 8.5.1 单倍体单株的所有器官中激活和沉默位点比较
• 8.5.2 不同单倍体单株中总体变化位点在各个器官中的比较
• 8.5.3 同一位点在不同单倍体单株中的差异表达
• 9 同一单倍体的整体表达变化
• 第四部分 讨论
• 1 关于减数分裂中的正常染色体数的配子与异交结实率
• 2 双胚苗水稻中的倍性变化和甲基化研究的优势
• 3 水稻单倍体基因组的甲基化率
• 4 单倍化与甲基化模式的改变
• 5 关于甲基化变异的位点特异性
• 6 芯片中的倍性敏感序列在表达量的调节
• 7 倍性敏感序列与成簇分布
• 8 单倍体与9311的功能分类
• 9 基因芯片分析数据与RT-PCR结果的差异
• 10 单倍体中不同器官的RT-PCR的差异
• 11 cDNA-AFLP技术的可靠性
• 12 单倍化后植株在RNA水平发生的激活和沉默
• 13 单倍化后cDNA-AFLP技术中的表达模式的变化
• 14 关于cDNA-AFLP技术中的特异性
• 15 沉默与激活比例差异
• 16 RT-PCR与cDNA-AFLP中的器官特异性比较
• 17 DNA与RNA水平的比较
• 18 基因表达与进化的关系
• 第五部分 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文情况