论文摘要
目的：通过波动性高浓度葡萄糖诱导内皮细胞凋亡模型，及用促红细胞生成素对波动性高血糖致内皮细胞毒性的干预，探索波动性高血糖促进搪尿病慢性血管并发症的病理机制，验证Epo抑制血管内皮细胞凋亡，并初步研究其机制。同时为临床筛选具有预防糖尿病血管并发症的药物提供理论线索。方法：从人脐静脉中分离并体外培养人脐静脉内皮细胞，实验分为3组，分别加入含不同浓度葡萄糖（5.6mmol／L，5.6／20mmol／L每24小时轮换1次，5.6／20mmol／L每24小时轮换1次+Epo）的条件培养液，每间隔24小时更换新鲜条件培养液一次，一共培养7天。AO／EB染色荧光显微镜观察细胞形态、DNA片段化检测、Annexin V／PI标记后流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期。用荧光分光光度仪检测细胞内活性氧。结果1)经AO／EB荧光染色后荧光显微镜下计算凋亡指数：正常对照组、波动性高糖组、波动性高糖干预组（Epo浓度为100U／ml）的凋亡指数分别为：（5.7125±0.37583）％、（22.1375±1.50612）％（16.3125±0.09910）％。与正常对照组相比、波动性高糖组凋亡指数增大，差异有统计学意义（P=0.000）。与波动性高血糖组，波动性高糖干预组的凋亡指数减小，差异有统计学意义（P=0.029）。2) DNA片段化检测结果：琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色后，波动性高糖组观察到典型的梯形条带。波动性高糖干预组也隐约可以看到。3) AnnexinV-FITC／PI双染FACS检测结果：正常对照组、波动性高糖组、波动性高糖干预组的凋亡率分别为：（6.3125±0.21002）％，（18.2750±0.45277）％，（15.0250±0.26049）％。与正常对照组相比，波动性高糖组的凋亡率凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P=0.000）；波动性高糖干预组的凋亡率明显低于波动性高糖组，差异有统计学意义（P=0.032）。4)与正常对照组相比，波动性高糖组G0／G1期比例明显增高，差异有统计学意义（P=0.000）而S和G2／M期比例降低，差异有统计学意义（P=0.013）；表明波动性高糖可延缓细胞G0／G1期向S转化。与波动性高糖组相比，波动性高糖干预组G0／G1期比例明显降低，差异有统计学意义（P=0.023），S和G2／M期比例升高，差异有统计学意义（P=0.015）。提示Epo可缓解波动性的高血糖引起的S期阻滞。正常对照组、波动性高糖组、波动性高糖干预组的增值指数分别为42.04％、16.12％、25.28％。与正常对照组相比，波动性高糖组增殖指数下降，差异有统计学意义（P=0.009）。与波动性高糖组相比，波动性高糖干预组的增殖指数明显增加，差异有统计学意义（P=0.021）。5)正常对照组、波动性高糖组、波动性高糖干预组（Epo浓度为100U／ml）活性氧数值分别为：（56.2500±5.97016）、（261.3750±19.84898）、（188.1250±6.66414）。与正常对照组相比，波动性高糖组的活性氧明显增高，差异有统计学意义（P=0.000）。与波动性高糖组相比，波动性高糖干预组活性氧产生下降，差异有统计学意义（P=0.017）。结论1)波动性高血糖诱导内皮细胞凋亡的作用明显强于正常组；2)波动性高血糖抑制体外培养的脐静脉内皮细胞的增殖，阻滞细胞周期的转化；3) Epo对血糖波动造成的内皮细胞凋亡具有保护作用，其可能机制是通过减少细胞内活性氧和减少细胞周期的S期阻滞。