1，3取代吡唑啉酮类试剂的合成及其用于糖类物质的衍生化和分析研究

论文摘要

随着分子生物学和细胞生物学的发展,糖类物质作为构建生命体的第三类生物大分子,其生物功能不断被人们所认识。现代科学已证明生物体内的糖类物质不仅仅是生命体能源的提供者,而且还作为重要的信息分子承载着数倍于核酸和蛋白质的生物信息,在生命活动中起着十分重要的作用。人类许多恶性疾病的发生和发展与人体蛋白质糖基化异常和表达量密切相关。对糖链进行定性定量分析研究有助于阐明糖链的生物学功能和相关疾病的发病机理。然而,由于天然糖类物质结构的复杂性、非模板性以及糖蛋白糖链的微量性,使现代分析技术对糖类的分析面临严峻的挑战。一个主要的问题是糖类物质极性大、缺乏光学吸收基团,无法满足高灵敏度分析手段检测的需要。衍生化可使糖链带上紫外或荧光基团,满足高灵敏度光学检测的需要,还可提高糖链的离子化效率,为糖类物质的分析开辟了一条新的道路,是目前HPLC、CE以及MS等现代分析技术研究糖类物质重要的样品前处理手段。在众多的衍生试剂中,1,3取代的吡唑啉酮类衍生试剂和糖类物质的反应在弱碱性介质中进行,和其它在酸性介质中反应的衍生试剂相比,具有不丢失糖链上酸性残基、适于多种类型糖链分析等优点。但该类试剂种类少,不能满足当前结构复杂的糖类物质分析的需要。尽管1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）在糖类物质的研究中被广泛接受和使用,但因缺乏相应的同位素标记试剂,有关PMP同位素标记-质谱相对定量分析糖链的研究目前仍属空白。本文据此进行了1,3取代的吡唑啉酮类试剂的合成及其应用于糖类物质的衍生化和分析研究,以期为糖生物学的进步提供方法参考。取得的主要研究结果如下：1.采取冰乙酸催化无溶剂反应体系,在常温下合成了产率理想的氘代（d5）PMP以及PMP类似物——1,3-二苯基-5-吡唑啉酮（DPP）和1-（4-异丙苯基）-3-甲基-5-吡唑啉酮（PPMP）.运用1HNMR、13CNMR、MS以及UV光谱等对产品的结构进行了表征。经初步研究比较表明,三种试剂中,d5-PMP和乳糖的反应活性最高,衍生物以双分子标记物为主；DPP的反应活性最低,不适用于糖类物质的衍生化分析；PPMP的反应活性仅次于d5/d0-PMP,生成单分子标记物的倾向较大,优化衍生条件使其定量进行可用于糖类物质分析。2.首次研究了d0/d5-PMP同位素标记在质谱相对定量分析糖类物质中的应用。建立了基于d0/d5-PMP同位素标记技术的糖蛋白N-糖链的质谱定量方法。阐述了该法的原理是建立在d0/d5-PMP和糖类物质定量衍生反应的基础之上。将来源于两种样品中的游离N-糖链分别用d0/d5-PMP衍生后,将衍生物按照等摩尔比混合后进质谱分析,在质谱图中,相同糖链会出现分子量相差10 Da的对峰,据此,对糖链进行定性分析；由于同位素糖链之间离子化效率相似,对峰之间丰度的差异表明了两种标记来源的糖链在量上的差异,据此实现定量分析。通过对标准游离葡寡糖、标准糖蛋白Ribo B（牛胰核糖核酸酶B）和fetuin（胎牛蛋白）中由PNGase F酶解得到的N-糖链进行分析,表明了该法具有同位素样品混合比例在10倍以内的定量线性动态范围,重复性变异系数CV≤8.34%,相对误差RE≤5.1%。并据此对人奶和牛奶中的游离寡糖进行了定性定量比较,结果令人满意。建立了糖蛋白O-糖链的解离和d0/d5-PMP同位素同时标记-质谱相对定量的分析方法。阐述了该法的原理是建立在糖蛋白O-糖链在p-消除反应中的解离条件和PMP标记糖链衍生化反应条件具有相似的碱性介质,可以实现在同一碱性介质中O-糖链解离和标记的同时完成。据此,本实验用氨水代替p-消除反应中的0.1 mol·L-1 NaOH溶液,用0.5 mol·L-1d0/d5-PMP溶液代替p-消除反应中的1.0mol·L-1NaBH4溶液,利用“一锅反应”,对糖蛋白O-糖链进行非还原性解离和d0/d5-PMP同位素标记。产物经纯化、等摩尔量混合后,进行ESI-MS或MALDI-TOF-MS定性及相对定量分析。本实验以胎牛蛋白fetuin和猪胃粘蛋白mucin中的O-糖链为研究对象,对该法进行了定量验证和评价。结果表明,该法具有10倍以内的线性动态范围和RE≤17.2%的相对误差,重复性变异系数CV%≤7.48%（n=3）。可用于两种不同来源的fetuin和mucin蛋白中0-糖链的定量分析。该方法将O-糖链的碱性解离和PMP标记同时实现,克服了甲基化同位素标记定量方法中同位素峰质量差随糖链大小变化的缺点,操作步骤简单,为O-糖组的研究提供了方法参考。此研究结果表明,基于糖链还原端衍生化技术的d0/d5-PMP同位素标记-质谱相对定量糖链的方法,对N-糖链和O-糖链的分析均适用,并且衍生物在245nm有较强的UV吸收,结合MS/MS2、HPLC、CE及其相关联用技术,可以获得未知样品中糖链精确的定性定量信息,在比较糖组定量学研究中具有可观的应用价值。3.首次研究了PPMP试剂在糖类物质的衍生化和组成分析方面的应用。建立了PPMP柱前衍生HPLC-ESI-MS/MS2在线联用分析单糖组成的方法。以葡萄糖为研究对象,确定了最佳衍生化条件和衍生物结构,表明在单糖与PPMP摩尔比为1：6-7,反应温度80℃,反应时间70 min的衍生条件下,得到主产物为单分子PPMP标记的糖链衍生物。通过和PMP进行对比,表明该PPMP单分子衍生物具有比双分子衍生物较好的稳定性和色谱分离性能,并且过量衍生试剂更易去除等优点。实现了12种常见单糖的单分子PPMP衍生物的HPLC分离和ESI-MS/MS2在线监测；获得了13种单糖的单分子PPMP衍生物的质谱特征碎片,对其进行了归属分析,可以用于单糖的定性判断；将该法用于天然螺旋藻多糖的单糖组成分析,取得了可靠的分析结果；并首次证实了螺旋藻多糖SPPB-1中存在一种还原性6,7-脱氧庚糖。该方法具有快速、准确、重现性好、样品处理简单等特点,适于生物样品中单糖组成的常规分析。建立了PPMP柱前衍生HPLC-ESI/MS在线联用分析寡糖混合物的方法。以葡寡糖混合物为研究对象,探索了PPMP对寡糖的衍生化效果和衍生物的ESI-MS分析。表明PPMP和葡寡糖标记的主产物仍为单分子标记物,此单分子标记物在ESI-MS的正负离子模式检测下均具有良好的响应。成功实现了PPMP柱前衍生化HPLC-ESI/MS联用分析寡糖混合物的可行性,建立了PPMP柱前衍生HPLC-ESI/MS在线联用分析寡糖混合物的方法。将该法用于经生物膜过滤的分子量小于1500 Da的壳寡糖混合物的分析,取得了满意的结果。该法兼顾了HPLC的高效分离和MS的高灵敏度、定性准确的优点,具有样品处理简单、分析速度快、分析结果准确可靠等优点,可作为寡糖样品在质量控制、构效关系研究等方面的方法参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 糖类物质的分析技术
• 1.2.1 高效液相色谱技术（HPLC）
• 1.2.2 生物质谱技术
• 1.2.3 高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）
• 1.3 糖类物质的衍生化技术
• 1.3.1 还原端的衍生化方法
• 1.3.2 非还原端的衍生化方法
• 1.4 同位素标记衍生化技术在质谱定量糖组学中的应用
• 1.4.1 利用甲基化反应
• 1.4.2 利用还原氨化反应
• 1.4.3 其他类型方法
• 1.5 总结与展望
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 1,3取代的吡唑啉酮类试剂的合成
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 1-（d5-苯基）-3-甲基-5-吡唑啉酮（d5-PMP）的合成
• 2.2.3 1,3-二苯基-5-吡唑啉酮（DPP）的合成
• 2.2.4 1-（4-异丙基）苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PPMP）的合成
• 2.2.5 产品的结构表征
• 2.2.6 产品与还原糖的反应及其产物的质谱检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 催化剂、溶剂和超声波对合成产率的影响
• 2.3.2 产品的结构表征结果
• 2.3.3 DPP、PPMP及PMP的紫外光谱比较
• 2.3.4 DPP、PPMP和d5-PMP与糖类物质的初步标记及产物的ESI-MS分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 d5-PMP在N-糖链的同位素-质谱相对定量分析方面的应用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 Ribo B和fetuin糖蛋白N-糖链的解离
• 3.2.3 奶样中游离寡糖的分离
• 3.2.4 d0/d5 PMP与游离还原糖链的标记
• 3.2.5 ESI-MS检测条件
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 d0/d5 PMP同位素标记相对定量分析糖链的原理
• 3.3.2 d0/d5 PMP同位素标记相对定量分析糖链的方法评价
• 3.3.3 d0/d5 PMP同位素标记用于奶样中游离寡糖的定性及相对定量分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 d5-PMP在O-糖链的同位素-质谱相对定量分析方面的应用
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 以d0/d5-PMP同位素为标记试剂的O-糖链的非还原性解离与标记
• 4.2.3 目标糖链的纯化方法
• 4.2.4 ESI-MS检测条件
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 d0/d5-PMP同位素标记糖蛋白O-糖链的定量方法原理
• 4.3.2 糖链纯化方法的选择
• 4.3.3 方法验证与评价
• 4.3.4 猪胃粘蛋白中O-糖链的定性及相对定量分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 新合成试剂—PPMP在单糖组成分析方面的应用
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 标准单糖的PPMP衍生化
• 5.2.3 螺旋藻多糖样品SPPB-1的水解及衍生化
• 5.2.4 HPLC分离和ESI-MS检测条件
• 5.2.5 PPMP衍生物的稳定性实验
• 5.2.6 方法评价实验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 衍生物的结构
• 5.3.2 衍生化条件的确定
• 5.3.3 糖类物质PPMP衍生物的稳定性
• 5.3.4 13种标准单糖的PPMP衍生物的HPLC和MS分析
• 5.3.5 PPMP和PMP标记方法的比较
• 5.3.6 方法评价结果
• 5.3.7 螺旋藻多糖SPPB-1的单糖组成分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 新合成试剂—PPMP在寡糖混合物分析方面的应用
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 仪器与试剂
• 6.2.2 寡糖的PPMP衍生化
• 6.2.3 HPLC分离和ESI-MS检测条件
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 寡糖混合物的HPLC-ESI/MS分析方法的建立
• 6.3.2 壳寡糖样品的HPLC-ESI/MS在线联用分析
• 6.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 作者简介