Geotrichum sp. SYBC WU-3产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

论文摘要

脂肪酶作为一种重要的工业用酶,已经在工业中得到广泛的应用;筛选新的脂肪酶资源并研究其酶学性质对于其特殊应用具有一定意义。论文从自然界中筛选得到一株产脂肪酶的微生物,通过形态鉴定,确定其为地丝菌属,定名为Geotrichum sp. SYBC WU-3。论文研究了诱导剂和表面活性剂对Geotrichum sp. SYBC WU-3脂肪酶产生的影响。结果表明,三丁酸甘油酯、橄榄油、坚果复合油、吐温20、吐温80和乳化剂OP的加入可以促进Geotrichum sp. SYBC WU-3产生脂肪酶,当同时在培养基中加入坚果复合油和乳化剂OP或橄榄油和乳化剂OP时,可以诱导Geotrichum sp. SYBC WU-3产生一新的脂肪酶同工酶LIP-1,而组成型为LIP-2。采用单因素法和正交实验对Geotrichum sp. SYBC WU-3摇瓶培养基进行了优化,优化后的培养基为:蛋白胨5 g/L,酵母膏6 g/L,NaH2PO4 3 g/L,坚果复合油250 mL/L,乳化剂OP 25 mL/L;培养温度30℃,发酵时间72 h;脂肪酶活性较优化前（3.68 U/mL）提高了3.2倍。采用DEAE-离子层析、Sephadex G-100凝胶过滤及双水相萃取等方法分别纯化了Geotrichum sp. SYBC WU-3脂肪酶同工酶LIP-1、LIP-2。LIP-1较Geotrichum sp. SYBC WU-3脂肪酶粗酶纯化了15.6倍,回收率为11.15 %;LIP-2较Geotrichum sp. SYBC WU-3脂肪酶粗酶纯化了22倍,回收率为17.9 %。LIP-1、LIP-2均为低温碱性脂肪,在50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中以p-NPB为底物测定的最适反应pH均为9.5,在50 mmol/L pH 3.0-9.0范围Tris-HCl的缓冲液中表现比较稳定;最适作用温度分别为20℃、15℃;LIP-1在40℃以下性质稳定,在50℃的环境中失活迅速;LIP-2在40℃的环境中失活迅速。LIP-1对长链脂肪的水解能力较强,LIP-2对短链脂肪的水解能力强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 脂肪酶的定义及分类
• 1.1.2 脂肪酶的来源
• 1.1.3 脂肪酶的应用
• 1.1.4 脂肪酶的测定方法
• 1.1.5 微生物脂肪酶的性质
• 1.2 研究热点
• 1.2.1 生物柴油
• 1.2.2 手性合成
• 1.2.3 低温脂肪酶
• 1.3 研究内容
• 1.3.1 产脂肪酶微生物的筛选
• 1.3.2 诱导剂和表面活性剂对微生物脂肪酶的影响
• 1.3.3 摇瓶培养基的优化
• 1.3.4 脂肪酶的分离纯化
• 1.3.5 酶学性质的研究
• 第二章 产脂肪酶微生物的筛选及初步鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 主要仪器和设备
• 2.2.5 产脂肪酶微生物的筛选
• 2.2.6 脂肪酶酶活力的测定
• 2.2.7 发酵液蛋白含量的测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 产脂肪酶微生物的筛选
• 2.3.2 SYBC WU-3 菌株的鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 诱导剂对 Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶影响的初步研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 Geotrichum sp. SYBC WU-3 培养基
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 主要仪器和设备
• 3.2.5 脂肪酶酶活力的测定
• 3.2.6 发酵液蛋白含量的测定
• 3.2.7 数据分析
• 3.2.8 脂肪酶同工酶的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 油脂对Geotrichum sp. SYBC WU-3 产脂肪酶活力的影响
• 3.3.2 不同表面活性剂对Geotrichum sp. SYBC WU-3 产脂肪酶活力的影响
• 3.3.3 坚果复合油对Geotrichum sp. SYBC WU-3 产脂肪酶活力的影响
• 3.3.4 聚氧乙烯辛基苯基醚（乳化剂OP）对菌株产脂肪酶活力的影响
• 3.3.5 油脂和表面活性剂对菌株产脂肪酶的影响
• 3.3.6 油脂和表面活性剂对Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶同工酶的影响
• 3.3.7 Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶粗酶的酶学特性
• 3.4 讨论
• 第四章 Geotrichum sp. SYBC WU-3 产脂肪酶培养基的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 Geotrichum sp. SYBC WU-3 培养基
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 主要仪器和设备
• 4.2.5 菌体培养及胞外脂肪酶的获得
• 4.2.6 发酵菌体量测定方法
• 4.2.7 脂肪酶酶活力的测定
• 4.2.8 发酵液蛋白含量的测定
• 4.2.9 数据分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 Geotrichum sp. SYBC WU-3 菌体生长及产酶曲线
• 4.3.2 发酵培养基中碳源对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.3 酵母膏加入量对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.4 发酵培养基中氮源对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.5 蛋白胨加入量对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.6 无机盐对菌株产脂肪酶活力的影响
• 2PO₄ 加入量对菌株产脂肪酶活力的影响'>4.3.7 NaH₂PO₄加入量对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.8 培养基初始pH 值对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.9 摇瓶装液量对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.10 培养温度对菌株产脂肪酶活力的影响
• 4.3.11 正交实验
• 4.3.12 培养基优化后Geotrichum sp. SYBC WU-3 菌体生长及产酶曲线
• 4.4 讨论
• 第五章 Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶的分离纯化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 主要仪器和设备
• 5.2.4 盐析范围的确定
• 5.2.5 双水相萃取
• 5.2.6 脂肪酶酶活力的测定
• 5.2.7 发酵液蛋白含量的测定
• 5.2.8 数据分析
• 5.2.9 脂肪酶同工酶的测定
• 5.2.10 SDS-PAGE 电泳
• 5.3 结果
• 5.3.1 硫酸铵沉淀
• 5.3.2 脂肪酶同工酶LIP-1 的纯化
• 5.3.3 双水相萃取体系的确定
• 5.3.4 脂肪酶同工酶LIP-2 的纯化
• 5.4 讨论
• 第六章 Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶的酶学性质研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 试剂
• 6.2.3 主要仪器和设备
• 6.2.4 脂肪酶酶活力及蛋白含量的测定
• 6.2.5 数据分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 pH 对纯化后Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶活性的影响
• 6.3.2 pH 对纯化后脂肪酶稳定性的影响
• 6.3.3 温度对纯化后脂肪酶活性的影响
• 6.3.4 温度对纯化后脂肪酶稳定性的影响
• 6.3.5 纯化后Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶的酶学动力学
• 6.3.6 纯化后Geotrichum sp. SYBC WU-3 脂肪酶对不同底物的水解能力
• 6.4 讨论
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文