PRS基因cDNA克隆及葡萄RS基因转化胡萝卜的研究

论文摘要

白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜,本研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源,在构建花生cDNA文库的基础上,筛选RS基因;构建适于胡萝卜遗传转化的RS基因表达载体,应用农杆菌介导的遗传转化方法,开展葡萄RS基因的胡萝卜遗传转化,获得转基因植株,从而为筛选具有较高保健功能的胡萝卜新种质资源以及相关代谢途径的分子生物学、分子生态学研究奠定基础。主要研究结果如下: 1) 从富含白藜芦醇的花生“金花1012”幼果中提取总RNA,所获得RNA的A260/A280比值为1.89,A260/A230比值为2.03,达到了用以构建cDNA文库的质量要求;采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒,构建了花生幼果cDNA文库,其滴度达到了1×106pfu/ml,重组率达到99%以上。 2) 采用基于PCR技术的96孔板cDNA文库筛选法,利用RS基因高度保守序列设计的引物,筛选cDNA文库获得了2个RS基因的阳性cDNA克隆。同源分析结果表明,该两个cDNA相互间的碱基序列有94%的同源性,与已经报道的花生RS基因cDNA有90%以上的同源性。推测上述两个阳性克隆是花生RS多基因家族不同成员的cDNA。 3) 利用功能已经鉴定的葡萄RS基因cDNA和表达载体pCB,构建了适用于胡萝卜等双子叶植物遗传转化的表达载体。 4) 建立了高效的胡萝卜农杆菌介导的遗传转化与再生体系,利用该体系开展了胡萝卜的遗传转化,获得了200个以上的转基因植株和可望进一步获得100个以上转基因植株的抗性胡萝卜愈伤组织。上述转基因植株和抗性愈伤已经通过了GUS与PCR检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 白藜芦醇生物学作用
• 1.1 抗菌、抗病作用
• 1.2 抗氧化、抗衰老作用
• 1.3 抗肿瘤作用
• 1.4 雌激素作用
• 1.5 抗血小板凝聚作用
• 2 白藜芦醇合成的分子机理
• 3 胡萝卜的营养保健品质
• 4 转基因胡萝卜研究现状
• 第二章 花生幼果cDNA文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 材料准备
• 1.2.2 紫外线处理
• 1.2.3 总RNA提取
• 1.2.4 RNA质量检测
• 1.2.5 mRNA的纯化分离
• 1.2.6 cDNA第一链的合成
• 1.2.7 LD PCR扩增cDNA
• 1.2.8 蛋白酶消化
• 1.2.9 Sfi I酶切
• TM-400进行cDNA大小片段分级'>1.2.10 用CHROMA SPIN^TM-400进行cDNA大小片段分级
• 1.2.11 ds cDNA与λTriplEx2载体的连接
• 1.2.12 文库包装
• 1.2.13 菌株培养
• 1.2.14 未扩增文库滴度测定和重组克隆百分比的确定
• 1.2.15 文库的扩增
• 1.2.16 扩增后文库的滴定
• 2 结果分析
• 2.1 花生幼果总RNA提取
• 2.2 单链和双链cDNA的合成
• 2.3 双链cDNA的分级
• 2.4 cDNA与载体的连接与包装
• 2.5 cDNA文库扩繁与滴度测定
• 2.6 PCR鉴定插入片断大小
• 3 讨论
• 3.1 花生幼果总RNA的提取
• 3.2 cDNA文库的质量及其可能影响因素
• 第三章 利用花生幼果cDNA文库筛选RS基因cDNA
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 花生cDNA文库的准备
• 1.2.2 合成目的序列特异性引物与文库测序引物
• 1.2.3 cDNA文库和阳性孔噬茵体溶液的扩繁
• 1.2.4 PCR反应
• 1.2.5 电泳检测阳性孔
• 1.2.6 阳性孔噬茵体滴度测定
• 1.2.7 目标克隆的检出
• 1.2.8 目标克隆的转化
• 1.2.9 目标克隆的测序
• 1.2.10 基因序列比对
• 2 结果与分析
• 2.1 设计、合成引物
• 2.2 目标cDNA PCR扩增的模板最大稀释倍数的确定
• 2.3 cDNA文库和阳性孔噬茵体溶液的扩繁
• 2.4 PCR反应检测阳性克隆
• 2.5 目标克隆的保存和转化
• 2.6 目标克隆的鉴定
• 2.7 目标克隆的测序与分析
• 3 讨论
• 3.1 96孔板文库筛选的效率
• 3.2 CAG1和CAG2与RS基因多基因家族
• 第四章 葡萄RS基因转化载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 构建策略
• 1.2.2 pCB／pMD18-T-RS质粒制备
• 1.2.3 双酶切两种质粒DNA
• 1.2.4 目的片段回收
• 1.2.5 目的片段的连接
• 1.2.6 连接产物转入大肠杆菌感受态细胞
• 1.2.7 重组质粒的鉴定
• 2冻融法与电击法）'>1.2.8 重组质粒对农杆菌的转化（CaCl₂冻融法与电击法）
• 1.2.9 转化子的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 pCB／pMD18-T-RS两种质粒DNA的双酶切
• 2.2 重组质粒的鉴定
• 2.3 转化子的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.2 重组质粒和转化子的鉴定
• 第五章 RS基因农杆菌介导的胡萝卜遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 预备实验
• 1.2.1.1 基本培养基的选择
• 1.2.1.2 外植体各部分脱分化能力实验
• 1.2.1.3 胡萝卜愈伤组织对潮霉素敏感性实验
• 1.2.1.4 农杆菌EHA105对羧苄青霉素的敏感性实验
• 1.2.1.5 分化培养基的选择
• 1.2.2 无菌苗的获得
• 1.2.3 外植体的处理与愈伤的诱导
• 1.2.4 遗传转化
• 1.2.5 植株的再生培养
• 1.2.6 GUS染色
• 1.2.7 转基因植株DNA检测
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体不同部分脱分化情况
• 2.2 不同激素水平的两种培养基对愈伤组织诱导的影响
• 2.3 胡萝卜愈伤组织对潮霉素敏感性实验结果
• 2.4 农杆菌EHA105对羧苄青霉素的敏感性实验结果
• 2.5 分化培养基的选择
• 2.6 无菌苗的获得
• 2.7 外植体的处理与愈伤的诱导
• 2.8 遗传转化
• 2.9 植株再生
• 2.10 GUS检测
• 2.11 PCR检测
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌介导的胡萝卜遗传转化
• 小结
• 参考文献
• 附录1 缩略词及英汉对照
• 附录2 主要仪器与主要试剂
• 附录3 所用试剂与缓冲液的配制
• 附录4 培养基的配制
• 附录5 常用DNA Marker图
• 致谢