Surfactin体外抗肿瘤机理研究

论文摘要

实验采用的枯草芽孢杆菌Bacillus natto TK-1发酵产生的脂肽——surfactin,被广泛认为是一种安全高效的生物表面活性剂。它具有显著的抗菌,抗肿瘤,抗病毒及溶解血栓等功能,其中关于抗肿瘤和抗病毒功能的研究较少。课题组经过前期实验发现,surfactin能够通过线粒体途径诱导MCF-7乳腺癌细胞发生凋亡。线粒体通透性转换孔（MPTP,简称PT孔）作为细胞的“生命闸门”,在细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用。本文主要探讨PT孔在surfactin诱导的MCF-7乳腺癌细胞凋亡过程中的作用机理,以及ERK/MAPK通路与细胞增殖和凋亡的关系。surfactin诱导MCF-7乳腺癌细胞的PT孔开放与细胞凋亡的关系及作用机理,以及,ERK/MAPK通路对于肿瘤细胞生长增殖的影响。本论文以体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞株为研究对象,探讨surfactin对肿瘤细胞增殖和凋亡的作用,并深入探讨相关的作用机理。体外增长抑制实验表明,surfactin能显著抑制MCF-7乳腺癌细胞的增殖,这种抑制作用呈现出浓度和时间依赖关系,作用24h的IC50是40.2μg/mL,作用48h的IC50是32.3μg/mL。HE染色法和AO/EB、Hoechst33342/PI荧光双染发现,surfactin诱导MCF-7细胞发生典型的凋亡形态学改变。实验采用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察发现,经surfactin作用后,MCF-7细胞内的活性氧（ROS）水平和胞内游离钙离子（Ca2+）水平显著升高,这一趋势分别可被ROS抑制剂NAC和胞内Ca2+螯合齐BAPTA-AM所抑制,且Ca2+水平的升高是由ROS的大量生成所致。同时发现,ROS的升高将会导致PT孔的开放,PT孔专一性抑制剂CsA可以抑制其开放,PT孔的开放直接引起线粒体跨膜电位（△Ψm）的显著降低,这一趋势可被NAC、BAPTA-AM和CsA所抑制。通过免疫印迹（Western blotting）实验发现,PT孔开放后,线粒体内细胞色素C（Cyt C）减少,而胞浆内的Cyt C则逐渐增多,胞内caspase-9蛋白的表达量也随之增加。此外,p-ERK蛋白表达量降低,Bcl-2蛋白表达量也随之下调。综上所述,surfactin具有诱导MCF-7肿瘤细胞发生凋亡的作用,其凋亡机制可能与线粒体途径及PT孔的开放有关。另外,ERK/MAPK通路参与了surfactin对MCF-7细胞的增殖抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 纳豆及纳豆菌
• 1.2 Surfactin概述
• 1.3 肿瘤与乳腺癌
• 1.3.1 肿瘤概述
• 1.3.2 乳腺癌概述
• 1.3.3 乳腺癌的治疗
• 1.4 细胞凋亡与肿瘤
• 1.4.1 细胞凋亡概述
• 1.4.2 细胞凋亡与细胞坏死的区别
• 1.4.3 细胞凋亡与肿瘤的发生
• 1.4.4 细胞凋亡与肿瘤的治疗
• 1.5 细胞凋亡的信号转导通路
• 1.5.1 细胞凋亡通路概述
• 1.5.2 线粒体与细胞凋亡
• 1.5.3 线粒体通透转换孔（PT孔）与细胞凋亡
• 1.5.4 膜电位（ΔΨm）的变化与细胞凋亡
• 1.5.5 细胞色素C（Cyt C）释放与细胞凋亡
• 1.5.6 Caspase的活化与细胞凋亡
• 1.5.7 MAPK家族概述
• 1.5.8 Bcl-2家族与细胞凋亡
• 1.6 本论文的研究目的及意义
• 1.7 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与细胞株
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 主要培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Surfactin的制备
• 2.2.2 细胞体外培养
• 2.2.3 细胞体外增殖抑制实验
• 2.2.4 细胞形态学观察
• 2.2.5 WST-1细胞增殖实验
• 2.2.6 流式细胞术分析细胞凋亡率
• 2.2.7 细胞内ROS水平的检测
• 2+浓度的检测'>2.2.8 细胞内游离Ca²⁺浓度的检测
• 2.2.9 PT孔开放的检测
• 2.2.10 线粒体ΔΨm的测定
• 2.2.11 线粒体细胞色素C的检测
• 2.2.12 免疫印迹实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 Surfactin诱导MCF-7细胞凋亡
• 3.1.1 Surfactin对MCF-7细胞和L-02细胞体外增殖抑制实验（MTT）
• 3.1.2 细胞形态学观察实验
• 3.2 PT孔在surfactin诱导MCF-7细胞凋亡过程中的作用机理
• 3.2.1 ROS在surfactin诱导的MCF-7细胞PT孔开放和细胞凋亡中的作用
• 2+在surfactin诱导的MCF-7细胞PT孔开放和细胞凋亡中的作用'>3.2.2 Ca²⁺在surfactin诱导的MCF-7细胞PT孔开放和细胞凋亡中的作用
• 2+的相互关系'>3.2.3 ROS与Ca²⁺的相互关系
• 3.2.4 检测PT孔的开放
• 3.2.5 Surfactin对MCF-7细胞线粒体ΔΨm的影响
• 3.2.6 MCF-7细胞线粒体Cyt C的释放
• 3.2.7 MCF-7细胞caspase-9活性的检测
• 3.3 ERK/MAPK通路在surfactin诱导MCF-7细胞凋亡过程中的作用机理
• 3.3.1 p-ERK蛋白表达在surfactin诱导的MCF-7细胞中的变化
• 3.3.2 Bcl-2蛋白表达在surfactin诱导的MCF-7细胞中的变化
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 8 致谢