海水养殖鱼蛋白质感染因子（PrPC）的研究

论文摘要

蛋白质感染因子（proteinaceous infectious agent, prion）是蛋白本质、导致传染性海绵样脑病（transmissible spongiform encephalopathies, TSE）的致病因子,一般指感染因子蛋白（prion protein, PrP）的凝聚体。蛋白质感染因子种类多,物种分布广。养殖鱼类也可能通过饲料蛋白形成鱼类prion和鱼类TSE。因此本研究以重要的养殖鱼鲈鱼、牙鲆为研究对象,对蛋白质感染因子基因结构及组织表达进行了研究,取得以下结果:克隆鲈鱼和牙鲆蛋白质感染因子基因,获得鲈鱼、牙鲆PrPC基因序列。分析表明:鲈鱼PrP蛋白含有507个氨基酸,分子量约为54kD,pI约9.07;牙鲆PrP蛋白含有497个氨基酸,分子量约为52kD, pI约9.44。它们具有PrPC蛋白的典型特征:信号肽、基本结构、重复肽区域、疏水区域、二硫键、糖基化位点和一个糖基缩醛磷肌醇位点（GPI）。与红旗东方鲀、大西洋鲑和斑马鱼序列之间同源性变化很大,从28-68%,变化不等这两种鱼的同源性在68.4%。这两种鱼PrP疏水区域的氨基酸序列的相似性为72.2%,核苷酸序列的相似性77.9%。根据序列同源性分析,哺乳动物与鱼类之间相互传染TSE的风险很小。基因结构水平测序结果表明,在牙鲆中该基因是由单个外显子编码的,.采用染色体步移获得牙鲆PrP基因5’-侧翼核苷酸序列616bp,分析发现:该序列存在两个启动子及顺式调控元件En-1、E4BP4、AREB6及Amef-2等。利用半定量RT-PCR检测牙鲆PrPC基因组织表达,结果表明,PrPC基因在心脏、脑、肠、肝脏、肌肉、垂体、眼、脾、胃、腮、尾鳍、性腺、肾及血液组织中均有表达,其中脑中的表达量最大。肌肉注射Ca2+后, PrPC在各组织中的表达量均下降:其中心脏、肾脏PrPC表达变化最为明显。牙鲆淋巴囊肿瘤中PrPC变化,结果发现,正常牙鲆鱼组织心脏、肝脏、肾脏中PrPC的表达量高于感染淋巴囊肿病毒的相对应组织,早期瘤中PrPC表达量低于正常组织,后期囊肿瘤中PrPC表达量高于早期囊肿瘤。结果揭示,牙鲆PrP蛋白是一种正常的结构蛋白,推测其功能与信号转导及肿瘤发生相关。

论文目录

• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1、蛋白质感染因子（prions）的定义
• 2、蛋白质感染因子（prions）的研究背景
• 2.1 蛋白质感染因子（prions）的结构研究
• 2.2 蛋白质感染因子（prions）的功能研究
• 2.3 蛋白质致病因子的发生模型研究
• 2.4 蛋白质感染因子传播的种间障碍研究
• 2.5 蛋白质感染因子病害的预防和治疗
• 2.6 其他类型的蛋白质感染因子
• 2.7 Prion-like 和shadoo prion
• 2.8 鱼类蛋白质感染因子研究现状
• 3、真核生物基因表达调控研究进展
• 3.1 真核生物基因表达调控的特点
• 3.2 真核生物基因调控的顺式作用元件
• 3.3 真核生物基因调控的反式作用因子
• 3.4 真核生物基因转录的启动和调节
• 3.5 启动子的检测
• 3.6 DNA 结合蛋白的检测
• 3.7 基因转录活性的检测
• 4、本研究的意义与内容
• 第二章 鲈鱼和牙鲆 Prion基因的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 总RNA 的提取
• 1.3 cDNA 的合成及cDNA PCR 文库的构建
• 1.4 引物设计
• 1.5 鲈鱼、牙鲆PrP 编码基因片段扩增
• 1.6 连接测序
• 1.7 PrP cDNA 的3’RACE 与5’RACE
• 1.8 数据处理
• 2 结果
• 2.1 鲈鱼和牙鲆全序列PrP 基因的克隆
• 2.2 鲈鱼、牙鲆PrP 基因结构组成分析
• 3 讨论
• 3.1 PrP 基因的克隆方法
• 3.2 PrP 基因的结构变化与功能
• 3.3 序列进化与鱼类感染Prions 的风险性分析
• 第三章 牙鲆PrP 基因结构及5’侧翼序列的克隆与分析
• 1 材料方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA 的提取
• 1.3 引物设计与合成
• 1.4 Genome Walking 文库的构建
• 1.5 序列的拼接
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 3.1 基因组水平上的进化
• 3.2 5’侧翼序列分析
• 3.3 启动区域的比较
• 第四章 PrP 基因在牙鲆组织中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 样品处理
• 1.3 总RNA 的提取
• 1.4 逆转录反应
• 1.5 引物设计
• 1.6 牙鲆Prp 基因的表达分析
• 1.7 图像处理
• 2 结果
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 组织表达特异
• 2.3 肿瘤相关性分析
• 2+对PrpC 的影响分析'>2.4 Ca²⁺对PrpC 的影响分析
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章