镉诱导植物氧化代谢与钙信使的变化及分子机理

论文摘要

植物镉毒害作用的机理研究方兴未艾。研究镉诱导的植物氧化代谢与钙信使的变化及分子机理,是提高植物对镉耐性的基础;鉴于镉对植物极具毒性,对生物大分子N-或S-键具有强攻击力,对氧化代谢与钙信使的影响具有生物学上的普遍意义,该研究也有助于推动对动物和人镉毒理研究的深入和认识的深化。本文以普通玉米为试材,采用溶液培养,设置不同供镉浓度（0, 5, 20和100μmol/L Cd）和不同供镉时间（12﹑24﹑48﹑96和168 h）,研究（1）植物的氧化代谢,包括氧自由基含量、活性氧清除系统超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性,以及抗氧化剂抗坏血酸和谷胱甘肽含量的变化,以及SOD、CAT、APX、DHAR和GR的基因表达;（2）细胞钙信使变化,包括CaM含量和细胞膜系统Ca2+-ATPase活性的变化及相关基因表达;（3）镉的亚细胞分布特征。采用生物化学方法测定氧化代谢和钙信使的关键物质含量和相关酶活性的变化,采用cDNA末端快速扩增方法分离相关基因,采用Northern杂交方法研究相关基因表达特征;采用透射电镜—能谱技术研究镉的亚细胞分布特征。论文取得的主要结果与进展如下:1.玉米叶片和根系生物量随供镉浓度的增加而降低,叶片和根系生长的抑制程度随供镉时间的增加而增加,100μmol/L Cd处理168h后叶片和根系生物量比对照分别降低52.8%和33.3%;随镉处理浓度和处理时间的增加,玉米叶片和根系镉积累量增加;玉米根系细胞镉主要分布于细胞壁,而叶片细胞镉表现为液泡>细胞壁>细胞质,玉米主要通过镉分隔在液泡和质外体细胞壁来减轻镉的毒害。2.随镉处理浓度和处理时间的增加,叶片和根系O2.-产生速率、H2O2和丙二醛（MDA）含量迅速增加;镉处理下玉米叶片SOD活性以及Cu/Zn-SOD基因表达均受镉诱导增加,低镉处理下二者48 h后开始下降,但高镉处理（100μmol/L）下即使在培养168 h后SOD活性以及Cu/Zn-SOD基因表达量仍然较高,二者变化规律一致,镉在植物体内对SOD的调控是通过基因转录实现的。叶片CAT活性受低镉（5和20μmol/L）诱导显著增加,但24 h后逐步下降,而高镉处理（100μmol/L）CAT活性培养期间一直低于对照;叶片CAT基因表达量受镉（20和100μmol/L）诱导显著增加,但24 h后逐步下降,至培养168 h后仍明显高于对照。可见CAT活性与CAT基因表达变化并不十分吻合,在玉米叶片中镉对CAT的调控可能是通过转录后或翻译后修饰实现的。叶片APX活性受镉诱导显著增加,培养12 h后, 5, 20和100μmol/L处理分别较对照增加24%、67%和50%,此后随胁迫时间的延长逐步降低,100μmol/L镉处理在168 h后甚至低于对照;叶片APX基因表达受低镉（5和20μmol/L）诱导高于对照,至168 h表达量仍然较高,100μmol/L镉处理的APX表达量一直低于20μmol/L镉处理,说明镉可能是通过转录后或翻译后修饰而影响APX活性。3.低镉处理对于抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环途径作用不明显,低镉处理植株随处理时间的增加,叶片总抗坏血酸、还原型抗坏血酸（AsA）和氧化型抗坏血酸（DAsA）含量总体上变化不大,叶片DHAR活性及基因的转录表达总体上处于较低水平,与对照没有显著差异,说明玉米叶片DHAR基因的转录不受低镉胁迫的诱导。100μmol/L镉处理168h后,GR活性和总抗坏血酸含量明显增加,显示AsA-GSH循环可被长时间和高浓度的镉处理激活。4.不同镉处理下叶片Ca2+-ATPase活性均表现为细胞质膜>液泡膜、内质网膜>线粒体膜。镉诱导了玉米叶片生物膜系统Ca2+-ATPase活性的升高,但随镉处理浓度的增加和时间的延长,生物膜系统Ca2+ -ATPase活性在48 h（质膜、液泡膜和内质网膜）和24 h（线粒体膜）后又开始被镉抑制,其随镉处理浓度的增加和时间的延长逐步降低。叶片质膜Ca2+-ATPase基因转录表达的变化与其酶活性基本一致;镉诱导了玉米叶片钙调蛋白（CaM）基因的表达,CaM含量及其表达量均随镉处理浓度的增加和时间的延长逐步增强。镉对叶片质膜Ca2+-ATPase和CaM基因功能的调控是在转录水平进行。综上所述,镉胁迫下植物活性氧清除酶的活性增强,镉在基因转录水平调控SOD活性,对CAT和APX的调控是通过转录后或翻译后修饰而实现;低镉处理对于AsA-GSH循环途径作用不明显,但被长时间和高浓度的镉处理激活;镉诱导植物钙信使的变化是通过增强Ca2+-ATPase和CaM基因的转录而提高Ca2+-ATPase活性和CaM含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 镉污染及对动植物的毒害作用
• 1.2 植物耐镉的生理基础
• 1.2.1 镉的吸收和运输限制
• 1.2.2 镉的区室化分隔
• 1.2.3 镉的络合-螯合作用
• 1.2.4 氧化代谢调节
• 1.3 植物活性氧清除系统及其在环境胁迫中的作用
• 1.3.1 活性氧清除的酶系统
• 1.3.2 抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环途径
• 1.4 植物钙信使系统及其在环境胁迫中的作用
• 1.4.1 胞内钙
• 1.4.2 钙信号靶蛋白
• 2+ 运输系统'>1.4.3 Ca²⁺运输系统
• 1.4.4 钙信使对植物氧化代谢的调控作用
• 1.5 本文的研究契机和总体思路
• 1.5.1 研究契机
• 1.5.2 总体思路
• 第二章 镉暴露下植物镉吸收及镉的亚细胞分布特征
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料培养与实验设计
• 2.2.2 测定方法
• 2.2.3 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 生物量
• 2.3.2 植株镉含量
• 2.3.3 镉的亚细胞分布
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 镉诱导的植物活性氧清除酶系统的变化及分子机理
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料培养与实验设计
• 3.2.2 SOD、CAT 和APX 基因基因克隆与表达研究方法
• 3.2.3 活性氧及其清除酶系统测定方法
• 3.2.4 数据处理
• 3.3 结果与分析
• 2^.-产生速率，H₂O₂ 和MDA 含量'>3.3.1 O₂^.-产生速率，H₂O₂ 和MDA 含量
• 3.3.2 SOD 活性及基因表达特征
• 3.3.3 CAT 活性及基因表达特征
• 3.3.4 APX 活性及基因表达特征
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 镉诱导的AsA-GSH 循环途径的变化及分子机理
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料培养与实验设计
• 4.2.2 GR 和DHAR 基因克隆与表达研究方法
• 4.2.3 AsA-GSH 循环过程的生化测定方法
• 4.2.4 数据处理
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 抗坏血酸含量
• 4.3.2 DHAR 活性及基因表达特征
• 4.3.3 GSH、GSSG 和总谷胱甘肽含量
• 4.3.4 GR 活性及基因表达特征
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 镉诱导的植物钙信使系统的变化及分子机理
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料培养与实验设计
• 2+-ATPase 基因克隆与表达研究方法'>5.2.2 CaM 和质膜Ca²⁺-ATPase 基因克隆与表达研究方法
• 2+-ATPase 活性测定方法'>5.2.3 CaM 含量和Ca²⁺-ATPase 活性测定方法
• 5.2.4 数据处理
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 CaM 含量及其基因表达特征
• 2+-ATPAase 活性及基因表达特征'>5.3.2 Ca²⁺-ATPAase 活性及基因表达特征
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 全文结论、创新点与研究展望
• 6.1 全文结论
• 6.2 创新点
• 6.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 附:论文涉及的常用英文缩写的中英文对照