论文题目: 苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种学
作者: 郎志宏
导师: 黄大昉
关键词: 苏云金芽孢杆菌,基因,随机突变,转基因烟草,蛴螬防治
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 苏云金芽孢杆菌cry8类基因对叶甲科、金龟科等鞘翅目害虫具有毒杀作用。从菌株HBF-1中克隆的cry8C基因与cry8Cal基因有一个氨基酸的差异，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry8Ca2基因。本研究对cry8Ca2基因的活性做了进一步分析。利用随机突变方法，得到35个不同的独立克隆，分别在Bt无晶体突变株HD-73~-中表达，通过对铜绿丽金龟幼虫(蛴螬)的生物活性检测，得到两个杀虫活性明显提高的突变体；序列测定结果表明两个突变体分别在第439位的O(Gln)突变为P(Pro)和第642位E(Glu)突变为G(Gly)。以cry8Ca2基因为模板，通过PCR扩增得到九个不同末端缺失的基因片段，构建到pET21b载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，得到9个末端缺失的蛋白；通过生物活性检测，确定Cry8Ca2蛋白对蛴螬的活性区位于70-659个氨基酸之间。在上述研究的基础上，对编码Cry8Ca2蛋白的1-680氨基酸的核苷酸序列进行了改造和密码子优化，使其在植物中高效表达。优化的mcry8Ca2(modifiedcry8Ca2)与cry8Ca2基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca2基因的37％提高到46％。根据己知基因序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，利用PCR方法克隆了根部特异表达的启动子TobRB7，与发表序列有2个碱基的差异，TobRB7启动子与报告基因GUS连接转化烟草，实验证明TobRB7启动子可以驱动GUS基因在烟草根部特异表达。构建了四个植物表达载体pBTmCN(根特异性启动子TobRB7：mcry8Ca基因)、pBSmCN(组成型表达的启动子CaMV35S：mcry8Ca基因)、pBI121载体(CaMV35启动子：GUS基因)和pBTGN(根特异性启动子TobRB7：GUS基因)，其中pBI121和pBTGN载体作为阴性对照，将四个植物表达载体转化烟草，得到了转化植株。对转化植株进行PCR检测，证明外源基因已转入烟草基因组中；Western blot证明Cry8Ca2蛋白在转基因烟草植株中正确表达。将转基因植株接入黄褐丽金龟幼虫和铜绿丽金龟幼虫进行生物活性检测，阴性对照植株被蛴螬明显危害，转mcry8Ca2基因植株根部生长完好，发育正常，结果表明crySCa2基因可以在转基因植株中表达并且对蛴螬有毒杀作用，证明利用转基因植物防治地下害虫蛴螬是一个可行的途径。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
前言
1、苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因
1.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类
1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构
1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理
2、地下害虫蛴螬的危害与防治
3、苏云金芽孢杆菌cry8类基因的研究
4、Bt转基因植物的研究进展
4.1 Bt转基因植物概述
4.2 Bt基因的改造
4.3 昆虫对Bt产生抗性的问题
5、本研究的目的意义
第一部分 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry8Ca2的活性研究
第一章 cry8Ca2基因的随机突变分析
1.1 材料和方法
1.2 结果与分析
1.3 讨论
第二章 Cry8Ca2蛋白活性区的研究
2.1 材料和方法
2.2 结果与分析:
2.3 讨论
第二部分 改造的cry8Ca2基因在转基因烟草中的表达
第三章 Bt cry8Ca2基因的改造
3.1 材料与方法:
3.2 结果与分析
3.3 讨论
第四章 烟草根特异性启动子的克隆和活性分析
4.1 材料和方法
4.2 结果与分析
4.3 讨论
第五章 mcry8Ca2基因在转基因烟草中的活性分析
5.1 材料与方法
5.2 结果与分析
5.3 讨论
结论
参考文献
博士后期间发表的文章和申请专利
致谢
发布时间: 2007-09-18
参考文献
- [1].苏云金芽孢杆菌vip3A基因及杀虫防病工程菌研究[D]. 吴燕榕.福建农林大学2004
- [2].苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平.中国农业科学院2003
- [3].苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D]. 黄志鹏.福建农林大学2005
- [4].苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究[D]. 黄必旺.福建农林大学2005
- [5].苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究[D]. 罗兰.西北农林科技大学2005
- [6].苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D]. 黄天培.福建农林大学2006
- [7].苏云金芽孢杆菌LLP29菌株的分离及其对白纹伊蚊作用机理的研究[D]. 张灵玲.福建农林大学2007
- [8].苏云金芽孢杆菌新助剂筛选及发酵因子优化[D]. 黄勤清.福建农林大学2006
- [9].苏云金芽孢杆菌FS140菌株蛋白酶的研究[D]. 郑毅.福建农林大学2008
- [10].高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D]. 姚江.中国农业科学院2002
相关论文
- [1].苏云金芽孢杆菌特殊异性cry基因的研究[D]. 宋福平.东北农业大学2001
- [2].高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D]. 姚江.中国农业科学院2002
- [3].苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平.中国农业科学院2003
- [4].高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究[D]. 王广君.中国农业科学院2005
- [5].苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D]. 黄志鹏.福建农林大学2005
- [6].苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D]. 黄天培.福建农林大学2006
- [7].苏云金芽孢杆菌LLP29菌株的分离及其对白纹伊蚊作用机理的研究[D]. 张灵玲.福建农林大学2007
- [8].苏云金芽孢杆菌新助剂筛选及发酵因子优化[D]. 黄勤清.福建农林大学2006
- [9].苏云金芽胞杆菌G03的芽胞形成相关基因对cry基因表达的影响[D]. 孙长坡.中国农业科学院2007
- [10].苏云金芽孢杆菌YBT-1520全基因组测序和比较基因组学研究[D]. 刘贵明.浙江大学2008