洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的高效表达、纯化及其体外复性的研究

论文摘要

生物柴油作为理想的可再生清洁能源,是解决能源危机的重要途径之一,也是未来新能源开发的主要方向。相较于化学法,脂肪酶法制备生物柴油具有条件温和、转化效率高、环境友好等优点。但脂肪酶价格昂贵,导致生物柴油成本偏高,缺乏市场竞争力,已严重制约着酶法生产生物柴油工艺的产业化发展。因此,制备低成本脂肪酶对于生物柴油产业的发展具有重大意义。本文以理想的生物柴油专用脂肪酶——洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶为对象,扩增并表达了该脂肪酶及其折叠酶基因,研究了折叠酶辅助下脂肪酶的体外复性过程,并对复性后的脂肪酶的应用进行了初步探索。主要研究工作和结果如下:1.扩增了G63脂肪酶及其折叠酶基因,并实现了二者在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。根据生物信息学方法对脂肪酶信号肽进行预测,利用pET-28a（+）质粒对N端删除40个氨基酸残基信号肽的脂肪酶进行了表达。脂肪酶胞内表达以包涵体形式存在,利用高压/超声波破碎、脱氧胆酸钠处理的洗涤纯化方法制备了高纯度的脂肪酶包涵体,包涵体溶解于8M的脲中,包涵体蛋白质含量达到50mg/g cell-wet weight,包涵体用尿素溶解后浓度为4.085mg/mL。对折叠酶跨膜区域进行预测,利用pET-28a（+）质粒对N端删除疏水性跨膜区域的折叠酶进行表达。折叠酶融合蛋白在胞内以可溶形式表达,表达产物N端携带6×His标签,利用Ni-NTA金属亲和层析的方法制备了高纯度的折叠酶,透析除去咪唑后折叠酶的蛋白质浓度为0.67mg/mL。2.研究了变性脂肪酶在折叠酶的辅助下的体外复性过程。对复性过程中的折叠酶/脂肪酶摩尔比、温度、时间、pH及蛋白质浓度等相关因素进行了考察,结果表明:当蛋白质浓度较低（0.8μg/mL）时,在复性条件（折叠酶/脂肪酶摩尔比1:1,温度15℃,时间5小时及pH7.0）下,脂肪酶复性后比活力可达1514.0U/mg;当蛋白质浓度较高（80μg/mL）时,在复性条件（折叠酶/脂肪酶摩尔比1:1,温度15℃,时间40小时及pH7.0）下,脂肪酶比活力则达到2284.8U/mg。3.对复性后的脂肪酶进行了简单的工程化处理。将复性后的脂肪酶溶液分别进行冻干和固定化处理,以拓展其应用范围和潜力。冷冻干燥处理的复性脂肪酶水解酶活:pNP法为694U/mg,橄榄油法为213U/mg;固定化的复性脂肪酶水解pNPP的比酶活为770.752U/mg。对复性脂肪酶后处理的探索,是推进复性脂肪酶工业化生产的一次尝试,具有方法学上的借鉴意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 脂肪酶概述
• 1.2 脂肪酶的结构与催化类型
• 1.3 脂肪酶的折叠与分泌
• 1.4 大肠杆菌表达系统
• 1.5 脂肪酶的体外复性研究
• 1.6 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的性质与应用
• 1.7 本课题的研究目的和研究意义
• 2 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶及其折叠酶的克隆、高效表达以及纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 3 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的复性条件的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 4 对复性脂肪酶应用的初步探索
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 5 小结与展望
• 5.1 小结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录一 攻读硕士研究生期间发表的学术论文目录
• 附录二 基因序列