小麦麸皮多酚氧化酶的纯化及其酶学特性的研究

论文摘要

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种Cu金属蛋白酶，小麦籽粒当中的多酚氧化酶是造成面制食品褐变的主要因素，褐变不仅影响面制食品的营养价值还会降低其经济价值和感官品质。目前国内外对蔬菜、水果中PPO的分离纯化及酶学特性的研究较多，对小麦中PPO的分离纯化却鲜有报道。本实验以小麦品种安农0823麸皮为材料，通过酶液粗提取、硫酸铵分级盐析、Macro-prep DEAE柱层析、SephadexG-75柱层析等方法对其中的多酚氧化酶进行了纯化并对其酶学特性进行了研究，同时对提取、纯化过程中的工艺参数进行了探索和优化。结果表明：1)浸提法可以有效地提取小麦麸皮当中的PPO酶蛋白。2)适当的温度（4℃-10℃）、振荡频率（120r/min）、时长（8h-12h）、浸提系统的PH（PH6）可有效的保护提取过程中多酚氧化酶的活性，减少酶活性的损失。3)浸提系统添加3％的交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）可有效的提高PPO提取液的酶活力。4)提取的PPO酶活性最适PH为PH5,最适温度为37℃。5)硫酸铵分级盐析可有效的提高PPO酶蛋白纯化的效率。6)经Macro-prep DEAE柱层析、SephadexG-75柱层析后的PPO蛋白，经SDS-PAGE电泳显示为单一条带，大小分别为77KDa、78KDa和67.5KDa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 多酚氧化酶的研究进展
• 1.1.1 多酚氧化酶的命名
• 1.1.2 多酚氧化酶在植物体内的分布及组织定位
• 1.1.3 多酚氧化酶的主要生理机能及催化机理
• 1.1.4 多酚氧化酶的分子结构特点
• 1.1.5 多酚氧化酶的分子量大小
• 1.1.6 影响多酚氧化酶活性的因素
• 1.1.7 多酚氧化酶的利用
• 1.2 多酚氧化酶纯化的研究进展
• 1.2.1 层析技术研究进展
• 1.2.2 多酚氧化酶的纯化研究进展
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、试剂与设备
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 试验原材料的处理
• 3.2.2 麦麸中 PPO 粗酶液的提取
• 3.2.3 麦麸 PPO 酶促反应产物的吸收光谱分析
• 3.2.4 酶活性及蛋白质含量的测定方法
• 3.2.5 粗酶液的硫酸铵分级沉淀分析
• 3.2.6 PPO 的 Native-PAGE 电泳及活性染色
• 3.2.7 麦麸中 PPO 的柱层析纯化
• 3.2.8 PPO 的 SDS-PAGE 电泳鉴定纯度和分子量大小
• 3.2.9 冷冻干燥浓缩和超滤浓缩对 PPO 浓缩影响的比较
• 3.2.10 酶蛋白的质谱分析
• 4 结果与分析
• 4.1 PPO 提取的工艺及参数的优化
• 4.1.1 温度对 PPO 提取效果的影响
• 4.1.2 振荡频率对 PPO 提取的影响
• 4.1.3 提取时间对 PPO 酶活的影响
• 4.1.4 PH 对小麦 PPO 活性稳定性的影响
• 4.1.5 PVPP 含量的确定
• 4.1.6 PPO 酶促反应最适 PH 的测定
• 4.1.7 PPO 酶促反应最适温度的测定
• 4.2 麦麸 PPO 酶促反应产物的吸收光谱分析
• 4.3 粗酶液的硫酸铵分级沉淀分析
• 4.4 不同保存方式粗酶液酶活性的变化
• 4.4.1 PPO 粗提取液的常规保存
• 4.4.2 PPO 粗酶提取液的冻干保存
• 4.4.3 低温对 PPO 各沉淀组分溶液酶活性的影响
• 4.5 PPO 的 native-PAGE 电泳及活性染色
• 4.6 麦麸中 PPO 的柱层析纯化
• 4.6.1 PPO 蛋白的 Macro-prepDEAE 柱层析
• 4.6.2 PPO 蛋白的 SephadexG-75 柱层析
• 4.7 SDS-PAGE 电泳鉴定 PPO 的纯度和分子量大小
• 4.8 浓缩过程中 PPO 酶蛋白的变化
• 4.9 PPO 蛋白质谱检测结果分析
• 5 讨论
• 5.1 PPO 纯化研究的必要性
• 5.2 关于多酚氧化酶的提取
• 5.2.1 PPO 粗酶液的提取方法
• 5.2.2 提取参数
• 5.3 关于 PPO 的纯化
• 5.4 SDS-PAGE 蛋白条带质谱分析
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 在读期间发表论文